Fizyolojik veya Tümöral Bağlamlarda Yerleşik Hücreler Arasındaki Dinamiği ve Etkileşimleri Araştırmak için Bir İnsan Kemik İliği 3D Modeli

NOT: Kemik iliği benzeri omurga yapısını hazırlamak için, bu protokol boncukların HMEC-1 endotel hücreleri ve HS27A stromal hücreleri ile bifazik kalsiyum fosfat (BCP) boncukları üzerinde birleştirilmesine dayanır. BCP boncukları, belirli bir ortamla 3D yapısal şekillendirmeye izin veren bir iskele görevi görecektir. 1. Boncuk hazırlama ve sterilizasyon 1,5 mL’lik bir tüpte her kesici uç için 35-40 mg BCP boncuk (HA/β-TCP 60/40; 45-75 μm) tartın (altta polikarbonat membranlı küçük, silindirik, plastik bir kap) (bkz. Boncukları tarttıktan sonra, otoklav döngüsü sırasında kapağın açılmasını önlemek için 1,5 mL tüpün üstünden temiz bir iğne ile küçük bir delik açın (60 dakika boyunca 121 ° C) ve tüpleri kapalı steril bir kutuda dikey bir konuma yerleştirin. 2.3D Steril bir başlık altında kesici uç hazırlığı Steril polikarbonat hücre kültürü eklerini 6 delikli bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin. Steril BCP boncuklarını 1,5 mL’lik bir tüpten kesici uca dökün. Kesici ucun içine 350 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) damlatarak boncukları dikkatlice yıkayın ve ardından kuyucuğa 4,5 mL 1x PBS ekleyin. PBS’yi vakum veya 5 mL’lik pipet kullanarak çıkarın ve ucu kuyucuğun bir köşesine yerleştirerek atın. Yıkama adımını iki kez tekrarlayın. Boncuklar yıkandıktan sonra, sistemi bloke etmek için% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 1x PBS kullanın. Kesici uca 350 μL blokaj çözeltisini ve kuyuya 4,5 mL’yi dikkatlice ekleyin ve tüm plakayı bir inkübatöre 37 ° C’de, gece boyunca% 5 CO2’ye yerleştirin.NOT: Adım 2.1 ve 2.2, hücre tohumlamadan önce BCP boncuklarından iyon salınımını en aza indirmeye yardımcı olur. 3. Hücre hattı hasadı ve 3D bakım NOT: Bu inkübasyon adımından sonra, 3D yapı omurgasını oluşturmak için mikro çevresel hücreler eklenir. Bu sistem, SV40’tan büyük T antijeni ile ölümsüzleştirilen insan mikrovasküler endotel hücreleri olan HMEC-1’in ve katı BM benzeri bir yapı oluşturma yetenekleri ve endotel hücrelerinin dahil edilmesiyle uyumlulukları nedeniyle insan papilloma virüsü ile ölümsüzleştirilen insan kemik iliği stromal hücreleri olan HS27A’nın kullanımına dayanmaktadır. Sisteme hücre eklemeden önce, aşağıdaki inkübasyon ortamını hazırlayın:50 mL tam Osteo Farklılaşma Ortamı (ODM) için, 45 mL Dulbecco’nun modifiye kartal besiyeri (DMEM) + 5 mL FBS + 0.5 mL penisilin-streptomisin + 8 × 10-4 mg / L deksametazon + 2.16 g / L beta-gliserofosfat + 44 mg / L askorbik asit karıştırın. 50 mL tam HMEC-1 ortamı için, 45 mL MCDB 131 + 5 mL FBS + 0.5 mL penisilin-streptomisin +% 1 glutamin ikamesi + 1 mg / L hidrokortizon + 10 μg / L EGF karıştırın. Engelleme çözümünü sistemden çıkarın. 1 × 106 HMEC-1 hücreyi (vasküler bölmeyi temsil eden) ve 2 × 106 HS27A hücreyi (mezenkimal stromal hücre bölmesini temsil eden) 15 mL’lik bir tüpte karıştırın ve oda sıcaklığında 1.575 × g’da 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve 175 μL ODM (HS27A osteodiferansiyasyonu için spesifik ortam) ile 175 μL HMEC-1 ortamı (HMEC-1 hücre büyümesi için spesifik ortam) ekleyin. Her bir kesici ucun içine 3 × 106 toplam hücre içeren bu süspansiyonun 350 μL’sini dökün. Daha sonra, kombine ortamın 4.5 mL’sini (2.25 mL HMEC-1 ortamı + 2.25 mL ODM) plakanın kuyucuklarına hücreler olmadan dökün. Kesici uç içindeki hücreleri ve BCP boncuklarını homojenize etmek için karışımı 1 mL’lik bir mikropipetle nazikçe aspire edin ve birkaç kez dağıtın. Tüm karışımı kesici ucun altına yerleşecek şekilde ayırın.NOT: Birkaç kesici uç kültürlenmişse, bir ölü hacimli bir karışım hazırlaması önerilir. Örneğin, dört kesici uç kültürlenmişse, her zaman beş kesici uç için gereken hacmi hazırlayın. Endotel ve mezenkimal hücreler kesici uç içinde homojenize edildikten sonra, 6 delikli plakayı bir inkübatörün içinde 37 ° C’de, 3 hafta boyunca% 5 CO2’de tutun. 1 mL’lik bir mikropipet kullanarak ortamı kesici uçtan dikkatlice çıkararak ve kesici ucun köşesini rahatsız etmemek için ucu iç kesici uç duvarına yerleştirerek kesici ucun ve kuyucuğun içindeki ortamı haftada 2 kat değiştirin.NOT: Alınan süpernatant, daha sonra protein niceliği için herhangi bir adımda -80 ° C’de saklanabilir. 4. İlgilenilen hücrelerin sisteme eklenmesi NOT: 3 haftalık HMEC-1 ve HS27A kültürlenmesinden sonra, HS27A hücrelerinin osteodiferansiyasyonu sistemin sertleşmesini sağladı. Bu adımda, ekle ilgilenilen hematolojik hücreleri (eklenen hücrelerin sayısı 1 × 104 ila 1 × 106 arasında değişebilir) ekleyin. Eklenen hücreler, akut miyeloid lösemi hastalarından veya sağlıklı donörlerden gelen BCR-ABL onkogeni ve primer mononüklee CD34 + hücreleri ile transfekte edilen TF1 hücreleriydi. Bu adımda orta bileşimi değiştirin, çünkü ODM bileşiği hematolojik hücreler için toksiktir ve sistem sertleştirmesi yapıldıktan sonra eklemeye devam etmeye gerek yoktur. Örneğin, hematopoetik bakımı desteklemek için, hematopoetik hücre hatları için tam RPMI ile ODM ortamını değiştirin (RPMI, FBS’nin% 10’u ve penisilin-streptomisinin% 1’i ile desteklenir) veya birincil hematopoetik hücreler için IMDM. Haftalık 3D ortam (iki kez) değişiklikler için tamamlanmış HMEC-1 ortamı ve tamamlanmış RPMI/IMDM ortamından oluşan bir parti hazırlayın. Bu kombinasyon ortamında ilgilenilen hematolojik hücreleri yeniden askıya alın ve kesici uç içine ekleyin. Bir ilaç tedavi protokolü gerekiyorsa, tedavi etmeden önce ilgilenilen hücreleri ekledikten sonra 24 saat bekleyin ve kemik benzeri yapıya uymaları için zaman verin. 3D hücre kültürü dönemini gereksinimlere göre uyarlayın. Ortamı haftada iki kez yenileyin ( HMEC-1 tam ortam + RPMI tam ortam).NOT: 3B hücre kültürü boyunca, bazı yapışkan hücreler kesici ucun dışına kuyucukların dibine sızarak orta tüketimi artırabilir. Kesici ucun ötesinde hücre dağılımı olup olmadığını mikroskop altında kontrol edin ve gerekirse kesici ucu steril bir başlığın altındaki 6 delikli yeni bir plakaya yerleştirin. 5.3D kemik iliği benzeri deneysel sonuçlar NOT: 3B kültürlemeyi takiben, deneyin amaçlarına göre çeşitli sonuçlar elde edilebilir. Protein analiziNOT: 3D deney boyunca, kemik iliği benzeri yapıda bulunan hücreler tarafından salgılanan proteinler daha ileri analizler için toplanabilir.Kültür ortamı haftada 2 kez değiştirildiğinde, sistem içinde ilgilenilen proteinlerin üretimini değerlendirmek için alınan süpernatantı kesici ucun içinden -80 ° C’de saklayın. Hücreleri 3B yapıdan ayırma (hücrelerin sıralanması gerekiyorsa steril bir başlık altında)NOT: 3D kemik iliği benzeri sistemde kültürlenen hücreler alınabilir, sıralanabilir ve daha fazla analiz edilebilir.Deneyin sonunda, 15 mL’lik bir tüpte, 4.5 mL RPMI’yı, 0.4 mg / mL kollajenaz ile desteklenmiş 0.5 mL FBS ile karıştırın ve çözeltiyi 10 dakika boyunca 37 ° C’de ısıtın. Membranı düzgün bir şekilde kesmek için kesici ucu baş aşağı (üstteki beyaz membran tarafı) steril 6 delikli bir plaka kapağına yerleştirin. Membranı yanlardan kesmek için steril bir neşter kullanın, böylece beyaz bir katı disk elde edin. Diski adım 5.2.1’de hazırlanan ılık 15 mL tüpün içine yerleştirin. Tüpü 37 ° C’lik bir inkübatörde aktif bir tekerleğe yerleştirin ve sindirime izin vermek için 10 dakika boyunca inkübe edin (kollajenaz ile temas halinde). Çarpık bir analizden kaçınmak için tüm membranlara aynı inkübasyon süresini uygulayın. 10 dakika sonra, 15 mL tüpü oda sıcaklığında 1.575 × g’da 5 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatanı atın ve peleti 5 mL ılık 1x PBS’de yeniden askıya alın. NOT: Bu adımda, polikarbonat membran genellikle süpernatant fraksiyonda yüzdüğü için, steril bir pipet ucu kullanılarak atılabilir. Membran hala pelet içine dahil edilmişse, bırakın ve bir sonraki adımın sonunda çıkarın. Peleti 300 μL ılık tripsin içinde yeniden askıya alın, tüpü 10 s boyunca vorteksleyin ve 1 dakika boyunca 37 ° C’lik bir su banyosuna yerleştirin. 1 mL ılık saf FBS ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun. 1 mL’lik bir mikropipetle, diski tamamen ayırmak için ortamı mekanik olarak aspire edin ve dağıtın.DİKKAT: Aspirasyon / dağıtım adımı çok hızlı olmalıdır, aksi takdirde boncuklar ucun içinde tortu oluşturur. Tüpü 1.575 × g’da 5 dakika santrifüj yapın. Peleti FBS ile desteklenmiş 3 mL 1x PBS içinde yeniden askıya alın. Süpernatantı toplamadan ve bir toplama tüpüne yerleştirilmiş 35 μm hücre süzgecinden filtrelemeden önce boncukları 5 s tortuya bırakın. Alınan filtratın 1.575 × g’da 5 dakika boyunca santrifüj edilmesi. Canlılığı değerlendirmek için tripan mavisi olan hücreleri sayın ve akış sitometri analizlerine devam edin.NOT: Tripan mavisi inkübasyonundan sonra alınan canlı hücrelerin sayısı, sindirilmiş kesici uç başına ~ 1-2 × 105 hücredir. Alınan hücrelerin akış sitometrisi etiketlemesiNOT: 3D kemik iliği benzeri yapıdan alınan hücreler etiketlenebilir ve akış sitometrisi ile daha fazla analiz edilebilir. 3B ayrışmadan sonra farklı bölmeleri tespit etmek için antikorların bir karışımını kullanın. Burada, CD45 (ilgilenilen hematolojik hücreleri boyar), CD31 (vasküler kompartmanı boyar) ve CD73 (osteoblastik kompartmanı boyar) 50 μL PBS +% 2 FBS’de 1 μL’de kullanılmıştır. Buz üzerinde hazırlanan tüm hücreleri ve antikorları (4 °C) tüm işlem boyunca ışıktan uzak tutun.Peletleri antikor karışımında yeniden askıya alın ve ışıktan uzakta buz üzerinde 30-40 dakika inkübe edin. Hücreleri yıkamak için 1 mL PBS +% 2 FBS ekleyin ve 1.575 × g’da 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Alınan peleti 200 μL 1x PBS +% 10 FBS’de 4′,6-diamidino-2-fenilindol ile desteklenmiş olarak yeniden askıya alın (DAPI, seyreltilmiş 1:2.000). Aşağıdaki parametreleri kullanarak tüpleri bir sitometrede analiz edin: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. Tekli popülasyonu geçmek için FSC-H ve FSC-W grafik grafiği kullanın. Tekli fraksiyonda, canlı hücre popülasyonunu (DAPI-negatif) belirlemek için bir DAPI-A ve FSC-A grafik grafiği kullanın. DAPI-negatif popülasyon daha önce kapılıyken, CD45-pozitif popülasyonu belirlemek için bir APC-A ve FSC-A grafik grafiği kullanın. 3D kemik iliği benzeri yapının sabitlenmesiNOT: 3D BM benzeri yapının fiksasyonu genellikle immünohistokimya veya immünofloresan için hücreleri in situ görselleştirmek ve daha spesifik boyama için gerçekleştirilir.BM benzeri yapıyı sabitlemek için, kesici ucu (adım 4.3) eski plakadan 1x PBS ile doldurulmuş yeni bir 6 delikli plakaya aktarın. Ardından, kesici ucun içindeki ortamı nazikçe 1x PBS ile değiştirin.NOT: Oluşan yapıyı PBS ile yıkamayın; sıvının basıncı 3D yapıyı bozabilir. Kesici uç yıkandıktan sonra, yeni bir 6 delikli plakaya yerleştirin ve hem kuyuyu hem de kesici ucu yeni açılmış paraformaldehit (PFA)% 4 (1x PBS’de% 16 seyreltilmiş) ile doldurun. Sabitleme işleminin ışıktan uzakta oda sıcaklığında 4 saat ilerlemesine izin verin. Fiksasyon işleminin sonunda, kesici ucu 1x PBS ile bir kez yıkayın ve ışıktan 4 °C’de saklayın. Katı diski almak için kesici ucun altındaki membranı adım 5.2.2’de açıklandığı gibi kesin. Yapıyı kireçten arındırmak için EDTA’da (0,5 M, pH 8) 48 saat boyunca diski 4x inkübe edin. Yapıyı parafin içine yerleştirin ve 4 μm kalınlığında bölümleri dilimleyin. Otomatik bir immünostainer kullanarak, bölümleri anti-CD45, anti-CD73 ve Ki67 antikorları ile inkübe edin. Boyama işlemini bir anti-tavşan veya -fare at turpu peroksidaz (HRP) ve kromojenik bir substrat olarak 3,3′-diaminobenzidin ile görselleştirin ve Gill’s-hematoksilin ile karşı lekeleyin.