生理学的または子宮頸部の文脈における常在細胞間のダイナミクスと相互作用を調査するためのヒト骨髄3Dモデル

注:骨髄様骨格構造を調製するために、このプロトコルは、二相性リン酸カルシウム(BCP)ビーズ上のHMEC-1内皮細胞およびHS27A間質細胞とビーズを組み合わせることに依存しています。BCPビーズは、特定の媒体で3D構造の形成を可能にする足場として機能します。 1.ビーズの準備と滅菌 各インサート(底部にポリカーボネート膜を備えた小さな円筒形のプラスチック皿)ごとに35〜40 mgのBCPビーズ(HA / β-TCP 60/40、45〜75 μm)を1.5 mLチューブで計量します( 材料の表を参照)。ビーズの重量を量った後、オートクレーブサイクル(121°Cで60分間)中に蓋が飛び出さないように、1.5 mLチューブの上部にきれいな針で小さな穴を開け、閉じた滅菌ボックスにチューブを垂直に置きます。 2.3D滅菌フードの下で製剤を挿入します 滅菌ポリカーボネート細胞培養インサートを6ウェルプレートのウェル内に置きます。滅菌BCPビーズを1.5 mLチューブからインサートに注ぎます。インサート内に350 μLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を滴下してビーズを注意深く洗浄し、4.5 mLの1x PBSをウェルに追加します。PBSを取り出し、真空または5 mLピペットを使用してチップをウェルの隅に置いて廃棄します。洗浄手順を2回繰り返します。 ビーズを洗浄したら、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加した1x PBSを使用してシステムをブロックします。ブロッキング溶液350 μLをインサートに、4.5 mLをウェルに注意深く加え、プレート全体を37°C、5%CO2 のインキュベーターに一晩置きます。注:手順2.1および2.2は、細胞播種前のBCPビーズからのイオン放出を最小限に抑えるのに役立ちます。 3. 細胞株採取と3D維持 注:このインキュベーションステップの後、微小環境細胞を加えて3D構造骨格を形成します。このシステムは、固体BM様構造を形成する能力と内皮細胞の含有との適合性により、SV40からの大きなT抗原で不死化されたヒト微小血管内皮細胞であるHMEC-1と、ヒトパピローマウイルスで不死化されたヒト骨髄間質細胞であるHS27Aの使用に基づいています。 細胞をシステムに加える前に、以下のインキュベーション培地を準備してください。50 mLの完全骨分化培地(ODM)に対して、45 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)+ 5 mLのFBS + 0.5 mLのペニシリン-ストレプトマイシン+ 8 × 10-4 mg / Lのデキサメタゾン+ 2.16 g / Lのベータグリセロリン酸+ 44 mg / Lのアスコルビン酸を混合します。 50 mLの完全HMEC-1培地に対して、45 mLのMCDB 131 + 5 mLのFBS + 0.5 mLのペニシリン-ストレプトマイシン+ 1%のグルタミン代替物+ 1 mg / Lのヒドロコルチゾン+ 10 μg / LのEGFを混合します。. システムからブロッキングソリューションを削除します。1 × 106 HMEC-1細胞(血管コンパートメントを表す)と2 × 106 HS27A細胞(間葉系間質細胞コンパートメントを表す)を15 mLチューブで混合し、室温で1,575 × g で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、175 μLのHMEC-1培地(HMEC-1細胞増殖のための特異的培地)と175 μLのODM(HS27A骨分化のための特異的培地)を加えます。 各インサート内に合計3×10個の細胞を含むこの懸濁液を350 μL注ぎます。次に、細胞を含まない4.5 mLの混合培地(2.25 mLのHMEC-1培地+ 2.25 mLのODM)をプレートのウェルに注ぎます。混合物を穏やかに吸引し、1 mLマイクロピペットで数回分注して、インサート内の細胞とBCPビーズを均質化します。インサートの下部に落ち着くようにミックス全体を割り当てます。注:複数のインサートを培養する場合は、デッドボリュームが1つのミックス調製をお勧めします。たとえば、4 つのインサートを培養する場合は、常に 5 つのインサートに必要なボリュームを準備します。 内皮細胞と間葉系細胞がインサート内でホモジナイズされたら、6ウェルプレートをインキュベーター内で37°C、5%CO2 で3週間保持します。インサート内の培地とウェルを週に2回交換するには、1 mLのマイクロピペットを使用してインサートから培地を慎重に取り出し、チップをインサートの内側の壁に配置して、インサートの角を乱さないようにします。注:回収された上清は、後でタンパク質を定量するために、任意のステップで-80°Cで保存できます。 4.関心のあるセルのシステムへの追加 注:HMEC-1およびHS27A培養の3週間後、HS27A細胞の骨分化によりシステムの剛性が可能になりました。このステップでは、インサート内に目的の血液学的細胞を追加します(追加される細胞の数は、1×104 から1×106まで変化し得る)。追加された細胞は、 BCR-ABL 癌遺伝子を導入したTF1細胞と、急性骨髄性白血病患者または健康なドナーのいずれかに由来する初代単核CD34+ 細胞でした。 ODM化合物は血液細胞に対して毒性があり、システムの硬直化が完了したら添加を続ける必要がないため、このステップで培地組成を変更してください。たとえば、造血の維持をサポートするには、造血細胞株(10%のFBSと1%のペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMI)または初代造血細胞をIMDMに置き換えます。3D培地(週2回)の変更用に、50%完了したHMEC-1培地と50%完了したRPMI/IMDM培地のバッチを準備します。 目的の血液細胞をこのコンビネーション培地に再懸濁し、インサート内に追加します。薬物治療プロトコルが必要な場合は、目的の細胞を追加してから24時間待ってから治療し、骨のような構造に接着する時間を与えます。 要件に応じて3D細胞培養の期間を調整します。培地(50%HMEC-1完全培地+ 50%RPMI完全培地)を週に2回リフレッシュします。注:3D細胞培養の過程で、一部の接着細胞がインサートの外側からウェルの底に漏れ、培地消費量が増加する可能性があります。インサートを超えた細胞分散がないか顕微鏡で確認し、必要に応じて滅菌フードの下の新しい6ウェルプレートにインサートを交換します。 5.3D骨髄様実験結果 注:3D培養後、実験の目的に応じていくつかの結果を得ることができます。 タンパク質分析注:3D実験の過程で、骨髄様構造に存在する細胞によって分泌されるタンパク質を収集して、さらなる分析を行うことができます。培養液を週2回交換する場合は、インサート内から取り出した上清を-80°Cで保存し、系内で目的のタンパク質の産生を評価します。 3D構造からの細胞の解離(細胞を選別する必要がある場合は滅菌フードの下)注:3D骨髄様システムで培養された細胞は、検索、選別、およびさらなる分析が可能です。実験の最後に、15 mLチューブで、4.5 mLのRPMIと0.4 mg/mLのコラゲナーゼを添加した0.5 mLのFBSを混合し、溶液を37°Cで10分間温めます。 インサートを逆さま(白いメンブレン側を上に)滅菌済みの6ウェルプレートカバーに置き、メンブレンを適切に切り取ります。滅菌メスを使用して膜を側面から切断し、白い固体ディスクを取り出します。手順5.2.1で準備した温かい15mLチューブの中にディスクを置きます。 チューブを37°Cのインキュベーター内のアクティブホイールに入れ、10分間インキュベートして消化します(コラゲナーゼと接触)。すべてのメンブレンに同じインキュベーション時間を適用して、歪んだ分析を回避します。 10分後、15 mLチューブを室温で1,575 × g で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを5 mLの温かい1x PBSに再懸濁します。注:このステップでは、ポリカーボネート膜は通常上清画分に浮遊するため、滅菌ピペットチップを使用して廃棄できます。膜がまだペレットに含まれている場合は、そのままにして、次のステップの最後に取り除きます。 ペレットを300 μLの温かいトリプシンに再懸濁し、チューブを10秒間ボルテックスし、37°Cの水浴に1分間入れます。 1 mLの温かい純粋なFBSを加えて酵素消化を停止します。1 mLマイクロピペットを使用して、培地を機械的に吸引して分注し、ディスクを完全に解離させます。注意: 吸引/分注ステップは非常に速くなければなりません、さもなければビーズは先端の中に沈殿します。 チューブを1,575 × gで5分間遠心分離します。ペレットを10Sを添加した1x PBSの3 mLに再懸濁します。 ビーズを5秒間沈殿させてから上清を採取し、収集チューブに置いた35 μmのセルストレーナーでろ過します。回収したろ液を1,575 × gで5分間遠心分離します。トリパンブルーで細胞をカウントして生存率を評価し、フローサイトメトリー分析に進みます。注:トリパンブルーインキュベーション後に回収される生細胞の数は、消化されたインサートごとに~1-2×105 細胞です。 検索した細胞のフローサイトメトリー標識注:3D骨髄様構造から回収された細胞は、フローサイトメトリーによって標識し、さらに分析することができます。抗体を組み合わせて使用し、3D解離後のさまざまなコンパートメントを検出します。ここでは、CD45(目的の血液学的細胞を染色する)、CD31(血管区画を染色する)、およびCD73(骨芽細胞コンパートメントを染色する)を、50μLのPBS+2S中に1μLで使用した。準備したすべての細胞と抗体を、プロセス全体を通して光から離して氷上(4°C)に保管してください。ペレットを抗体ミックスに再懸濁し、光を避けて氷上で30〜40分間インキュベートします。 1 mLのPBS + 2Sを加えて細胞を洗浄し、1,575 × gで5分間遠心分離します。 回収したペレットを、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、1:2,000希釈)を添加した1x PBS + 10Sの200 μLに再懸濁します。 次のパラメータを使用してサイトメーターでチューブを分析します: FSC 297 PnV;SSC 220 PnV;ダピ 400 PnV;CD45 APC 505 PnV.FSC-H対FSC-Wグラフプロットを使用して、一重項母集団をゲートします。一重項画分では、DAPI-A対FSC-Aのグラフプロットを使用して、生細胞集団(DAPI陰性)を決定します。DAPI陰性集団を以前にゲートした状態で、APC-A対FSC-Aグラフプロットを使用して、CD45陽性集団を決定します。 3次元骨髄様構造の固定注:3D BM様構造の固定は、一般に、免疫組織化学または免疫蛍光法のために行われ、細胞を in situで 視覚化し、さらに特異的に染色します。BM様構造を固定するには、インサート(ステップ4.3)を古いプレートから1x PBSで満たされた新しい6ウェルプレートに移します。次に、インサート内の培地を1x PBSで慎重に交換します。注意: 形成された構造をPBSで洗い流さないでください。液体の圧力は3D構造を損なう可能性があります。 インサートを洗浄したら、新しい6ウェルプレートに入れ、ウェルとインサートの両方に開封したてのパラホルムアルデヒド(PFA)4%(1x PBSで16%希釈)を充填します。 固定プロセスを光から離れた室温で4時間進めます。 固定プロセスの最後に、インサートを1x PBSで1回洗浄し、光を避けて4°Cで保管します。 手順5.2.2の説明に従って、インサートの下部にあるメンブレンをカットして、ソリッドディスクを取り出します。 構造を脱灰するために、EDTA(0.5 M、pH 8)中でディスクを48時間インキュベートします。 構造をパラフィンに埋め込み、厚さ4μmの切片をスライスします。 自動免疫染色剤を使用して、抗CD45、抗CD73、およびKi67抗体で切片をインキュベートします。抗ウサギまたはマウスセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)および発色基質としての3,3′-ジアミノベンジジンによる染色を視覚化し、ギルヘマトキシリンで対比染色します。