מודל תלת-ממדי של מח עצם אנושי לחקר הדינמיקה והאינטראקציות בין תאים מקומיים בהקשרים פיזיולוגיים או גידוליים

הערה: כדי להכין את מבנה עמוד השדרה דמוי מח העצם, פרוטוקול זה מסתמך על שילוב חרוזים עם תאי אנדותל HMEC-1 ותאי סטרומה HS27A על חרוזי סידן פוספט דו-פאזיים (BCP). חרוזי ה-BCP ישמשו כפיגום המאפשר, עם מדיום מסוים, את העיצוב המבני התלת-ממדי. 1. הכנת חרוזים ועיקור שקלו 35-40 מ”ג של חרוזי BCP (HA/β-TCP 60/40; 45-75 מיקרומטר) עבור כל תוספת (צלחת פלסטיק קטנה, גלילית, עם קרום פוליקרבונט בתחתית) בצינור של 1.5 מ”ל (ראו טבלת חומרים). לאחר שקילת החרוזים, נשא חור קטן עם מחט נקייה דרך החלק העליון של צינור 1.5 מ”ל כדי למנוע את המכסה קופץ פתוח במהלך מחזור autoclave (121 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות), ומניחים את הצינורות במצב אנכי בתיבה סטרילית סגורה . 2.3D הכנס הכנה מתחת למכסה סטרילי שים תרבית תאי פוליקרבונט סטרילית מכניס בתוך בארות של צלחת 6 בארות. יוצקים חרוזי BCP סטריליים מצינור 1.5 מ”ל לתוך התוספת. שטפו את החרוזים בזהירות על ידי טפטוף של 350 μL של 1x מלח עם אגירת פוספט (PBS) בתוך התוסף ולאחר מכן הוסיפו 4.5 מ”ל של 1x PBS לבאר. הסר והשלך את ה- PBS באמצעות ואקום או פיפטה של 5 מ”ל על ידי הנחת הקצה בפינה של הבאר. חזור על שלב הכביסה פעמיים. לאחר שטיפת החרוזים, יש להשתמש ב-PBS אחד בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) כדי לחסום את המערכת. בזהירות להוסיף 350 μL של פתרון חוסם להוסיף 4.5 מ”ל לבאר ומניחים את כל הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לילה.הערה: שלבים 2.1 ו-2.2 עוזרים למזער את שחרור היונים מחרוזי BCP לפני זריעת התאים. 3. קצירת קו תאים ותחזוקת תלת מימד הערה: לאחר שלב דגירה זה, תאים מיקרו-סביבתיים מתווספים ליצירת עמוד השדרה של המבנה התלת-ממדי. מערכת זו מבוססת על שימוש ב- HMEC-1, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים המונצחים באנטיגן T גדול מ- SV40, ו- HS27A, תאי סטרומלים של מח עצם אנושיים המונצחים בנגיף הפפילומה האנושי, בשל יכולתם ליצור מבנה מוצק דמוי BM ותאימותם להכללת תאי אנדותל. לפני הוספת תאים למערכת, הכן את מדיית הדגירה הבאה:עבור 50 מ”ל של מדיום דיפרנציאציה אוסטאו מלא (ODM), יש לערבב 45 מ”ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) + 5 מ”ל של FBS + 0.5 מ”ל של פניצילין-סטרפטומיצין + 8 × 10-4 מ”ג/ליטר של דקסמתזון + 2.16 גרם/ליטר של בטא-גליצרופוספט + 44 מ”ג/ליטר של חומצה אסקורבית. עבור 50 מ”ל של מדיום HMEC-1 מלא, לערבב 45 מ”ל של MCDB 131 + 5 מ”ל של FBS + 0.5 מ”ל של פניצילין-סטרפטומיצין + 1% של תחליף גלוטמין + 1 מ”ג / ליטר של הידרוקורטיזון + 10 מיקרוגרם / ליטר של EGF. הסר את פתרון החסימה מהמערכת. ערבבו 1 × 10 6 תאי HMEC-1 (המייצגים את תא כלי הדם) ו-2 × 106 תאי HS27A (המייצגים את תא התא הסטרומלי המזנכימלי) בצינור של 15 מ”ל וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1,575 × גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט והוסיפו 175 מיקרו-ליטר של מדיום HMEC-1 (מדיום ספציפי לצמיחת תאי HMEC-1) עם 175 μL של ODM (מדיום ספציפי לאוסטאודיבנציה HS27A). יוצקים 350 μL של תרחיף זה המכיל 3 × 106 תאים סה”כ בתוך כל תוספת. לאחר מכן, לשפוך 4.5 מ”ל של המדיה המשולבת (2.25 מ”ל של HMEC-1 בינוני + 2.25 מ”ל של ODM) ללא תאים לתוך בארות של צלחת. בעדינות לשאוף ולפזר את התערובת מספר פעמים עם micropipette 1 מ”ל כדי homogenize את התאים ואת חרוזי BCP בתוך התוספת. הקצו את כל התערובת כדי להתיישב בתחתית התוספת.הערה: מומלץ להשתמש בתכשיר תערובת עם נפח מת אחד אם מספר תוספות מתורבתות. לדוגמה, אם ארבע תוספות הן בתרבית, הכן תמיד את אמצעי האחסון הדרוש לחמש תוספות. ברגע שתאי האנדותל והמזנכימליים הומוגניים בתוך התוספת, שמור את צלחת 6 הבאר בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 3 שבועות. שנה את המדיום בתוך התוסף ואת הבאר 2 פעמים בשבוע על ידי הסרה זהירה של המדיום מהתוסף באמצעות מיקרופיפטה של 1 מ”ל והנחת הקצה בקיר ההוספה הפנימי כדי למנוע הפרעה לפינת התוסף.הערה: ניתן לאחסן את הסופרנטנט שנשלף בטמפרטורה של -80°C בכל שלב, לכימות חלבון מאוחר יותר. 4. הוספת תאים מעניינים למערכת הערה: לאחר 3 שבועות של התרבות HMEC-1 ו-HS27A, האוסטאו-דיפרנציציה של תאי HS27A אפשרה את קשיחות המערכת. בשלב זה, הוסף תאים המטולוגיים בעלי עניין (מספר התאים שנוספו יכול להשתנות בין 1 × 104 ל- 1 × 106) בתוך התוספת. התאים שנוספו היו תאי TF1 שעברו טרנספקציה עם אונקוגן BCR-ABL ותאי CD34+ חד-גרעיניים ראשוניים שהגיעו מחולי לוקמיה מיאלואידית חריפה או מתורמים בריאים. שנה את הרכב המדיום בשלב זה, מכיוון שתרכובת ODM רעילה לתאים המטולוגיים ואין צורך להמשיך להוסיף אותה לאחר ביצוע קשיחות המערכת. לדוגמה, כדי לתמוך בתחזוקה המטופויאטית, החלף את מדיום ODM ב- RPMI מלא עבור קווי תאים המטופוייטיים (RPMI בתוספת 10% של FBS ו- 1% של פניצילין-סטרפטומיצין) או IMDM עבור תאים המטופויאטיים ראשוניים. הכינו אצווה של 50% מדיום HMEC-1 מלא ו-50% מדיום RPMI/IMDM מלא לשינויים התלת-ממדיים (פעמיים) בשבוע. השהה את התאים ההמטולוגיים המעניינים במדיום משולב זה והוסף אותו בתוך התוספת. אם נדרש פרוטוקול טיפול תרופתי, יש להמתין 24 שעות לאחר הוספת התאים המעניינים לפני הטיפול, ולתת להם זמן להיצמד למבנה דמוי העצם. התאימו את התקופה של תרבית תאים תלת-ממדית בהתאם לדרישות. רענן את המדיום (50% HMEC-1 מדיום שלם + 50% RPMI מדיום שלם) פעמיים בשבוע.הערה: במהלך תרבית התאים התלת-ממדית, חלק מהתאים הדבקים עשויים לדלוף מחוץ לתוסף לתחתית הבארות, מה שמגדיל את הצריכה הבינונית. בדקו מתחת למיקרוסקופ אם יש פיזור תאים מעבר לתוסף והחליפו את התוסף בצלחת חדשה של 6 בארות מתחת למכסה סטרילי במידת הצורך. 5.3D תוצאות ניסוי דמוי מח עצם הערה: בעקבות התרבות תלת-ממדית, ניתן להשיג מספר תוצאות בהתאם למטרות הניסוי. ניתוח חלבוניםהערה: במהלך הניסוי התלת-ממדי, ניתן לאסוף את החלבונים המופרשים על-ידי התאים הנמצאים במבנה דמוי מח העצם לצורך ניתוחים נוספים.כאשר מדיום התרבית משתנה 2x בשבוע, אחסן את הסופרנאטנט שנשלף מתוך התוסף בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי להעריך את הייצור של חלבונים בעלי עניין בתוך המערכת. ניתוק תאים מהמבנה התלת-ממדי (מתחת למכסה מנוע סטרילי אם יש צורך למיין תאים)הערה: ניתן לאחזר, למיין ולנתח את התאים שגודלו בתרבית במערכת דמוית מח עצם תלת-ממדית.בסוף הניסוי, בצינור של 15 מ”ל, יש לערבב 4.5 מ”ל של RPMI עם 0.5 מ”ל של FBS בתוספת 0.4 מ”ג/מ”ל של קולגן, ולחמם את התמיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מניחים את התוסף הפוך (צד הממברנה הלבן למעלה) על כיסוי סטרילי של 6 בארות כדי לחתוך את הממברנה החוצה כראוי. השתמש באזמל סטרילי כדי לחתוך את הממברנה מהצדדים, ובכך לשלוף דיסק מוצק לבן. הנח את הדיסק בתוך צינור 15 מ”ל חם מוכן בשלב 5.2.1. מניחים את הצינור בגלגל פעיל באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ודוגרים במשך 10 דקות כדי לאפשר עיכול (במגע עם קולגן). החל את אותו זמן דגירה עבור כל הממברנות כדי למנוע ניתוח מוטה. לאחר 10 דקות, צנטריפוגה של צינור 15 מ”ל למשך 5 דקות ב 1,575 × גרם בטמפרטורת החדר, להשליך את supernatant, ולהשהות את הכדור ב 5 מ”ל של PBS חם 1x. הערה: בשלב זה, מכיוון שממברנת הפוליקרבונט מרחפת בדרך כלל בשבר העל-טבעי, ניתן להשליך אותה באמצעות קצה פיפטה סטרילי. אם הממברנה עדיין כלולה בכדור, השאירו אותה והסירו אותה בסוף השלב הבא. לתלות את הכדור ב 300 μL של טריפסין חם, מערבל את הצינור במשך 10 שניות, ומניחים אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. עצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת 1 מ”ל של FBS טהור וחם. עם micropipette 1 מ”ל, מכנית לשאוף ולחלק את המדיום כדי לנתק לחלוטין את הדיסק.זהירות: שלב השאיפה/חלוקה חייב להיות מהיר מאוד, אחרת החרוזים ישקעו בתוך הקצה. צנטריפוגה את הצינור במשך 5 דקות ב 1,575 × גרם. יש להשעות את הכדור ב-3 מ”ל של PBS אחד בתוספת 10% FBS. השאירו את החרוזים למשקעים במשך 5 שניות לפני שאוספים את הסופרנטנט ומסננים אותו דרך מסננת תאים בגודל 35 מיקרומטר המונחת על צינור איסוף. צנטריפוגה את התסנין שנשלף במשך 5 דקות ב 1,575 × גרם. ספרו את התאים עם טריפן כחול כדי להעריך את הכדאיות והמשיכו לניתוחי ציטומטריה של זרימה.הערה: מספר התאים בני הקיימא שנשלפו לאחר הדגירה הכחולה של טריפאן הוא ~1-2 × 105 תאים לכל תוספת מעוכלת. תיוג ציטומטריה של זרימה של תאים שאוחזרוהערה: התאים שנשלפו מהמבנה דמוי מח העצם התלת-ממדי ניתנים לתיוג ולניתוח נוסף על-ידי ציטומטריה של זרימה. השתמש בתערובת של נוגדנים כדי לזהות את התאים השונים לאחר דיסוציאציה תלת-ממדית. כאן, CD45 (מכתים את התאים ההמטולוגיים המעניינים), CD31 (מכתים את תא כלי הדם) ו- CD73 (מכתים את התא האוסטאובלסטי) שימשו ב 1 μL ב 50 μL של PBS + 2% FBS. יש להרחיק את כל התאים והנוגדנים המוכנים על קרח (4 מעלות צלזיוס) מאור במהלך כל התהליך.יש לתלות את הכדורים בתערובת הנוגדנים ולדגור במשך 30-40 דקות על קרח, הרחק מהאור. הוסף 1 מ”ל של PBS + 2% FBS כדי לשטוף את התאים ואת הצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1,575 × גרם. השהה את הכדור המאוחזר ב-200 μL של 1x PBS + 10% FBS בתוספת 4′,6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI, מדולל 1:2,000). לנתח את הצינורות בציטומטר באמצעות הפרמטרים הבאים: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. השתמש בתרשים FSC-H לעומת FSC-W כדי לשער את אוכלוסיית הסינגלט. בחלק הסינגלט, השתמש בתרשים DAPI-A לעומת FSC-A כדי לקבוע את אוכלוסיית התאים בני הקיימא (DAPI-שלילי). כאשר האוכלוסייה השלילית של DAPI הייתה מגודרת בעבר, השתמש בתרשים APC-A לעומת FSC-A כדי לקבוע את האוכלוסייה החיובית ל-CD45. קיבוע של המבנה דמוי מח העצם התלת-ממדיהערה: קיבוע של המבנה דמוי BM התלת-ממדי מבוצע בדרך כלל עבור אימונוהיסטוכימיה או אימונופלואורסצנציה כדי לדמיין תאים באתרם ולהכתים ספציפיים נוספים.כדי לתקן את המבנה דמוי BM, העבר את התוספת (שלב 4.3) מהצלחת הישנה לצלחת חדשה בת 6 בארות מלאה ב- PBS 1x. לאחר מכן, החלף בעדינות את המדיום בתוך התוסף ב- PBS אחד.הערה: אין לשטוף את המבנה שנוצר עם PBS; הלחץ של הנוזל עלול לפגוע במבנה התלת-ממדי. לאחר שטיפת התוספת, הניחו אותה בתוך צלחת חדשה של 6 בארות ומלאו גם את הבאר וגם את התוסף בפרפורמלדהיד (PFA) שנפתח זה עתה ב-4% (מדולל ב-1x PBS). אפשרו לתהליך הקיבוע להתקדם במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר הרחק מאור. בסוף תהליך הקיבוע, יש לשטוף את התוסף פעם אחת עם PBS אחד ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס הרחק מאור. חתוך את הממברנה בתחתית התוסף כמתואר בשלב 5.2.2 כדי לאחזר את הדיסק המוצק. דגירה של הדיסק 4x במשך 48 שעות ב- EDTA (0.5 M, pH 8) על מנת לפרק את המבנה. מטמיעים את המבנה בפרפין ופורסים חלקים בעובי 4 מיקרומטר. באמצעות חיסון אוטומטי, דגרו את החלקים עם נוגדנים נגד CD45, אנטי-CD73 ו-Ki67. דמיינו את הכתמים עם סוס נגד ארנב או עכבר צנון פרוקסידאז (HRP) ועם 3,3′-דיאמינובנזידין כמצע כרומוגני וכתם נגדי עם המטוקסילין של גיל.