Ensayo de punto vacío en tiempo real

El almacenamiento de orina y la micción están coordinados por un circuito central (sistema nervioso central) que recibe información sobre el estado de llenado de la vejiga a través de los nervios pélvico e hipogástrico. El urotelio, el epitelio que recubre el tracto urinario desde la pelvis renal hasta la uretra proximal, forma una barrera estrecha contra los productos de desecho metabólicos y patógenos presentes en la orina. Es un componente integral de una red sensorial, que detecta y comunica el estado de llenado de la vejiga a los tejidos subyacentes y nervios aferentes ^1,2. La ruptura de la barrera urotelial, o alteraciones en las vías de mecanotransducción urotelial, puede conducir a una disfunción miccional junto con síntomas del tracto urinario inferior como frecuencia, urgencia, nicturia e incontinencia 3,4,5,6,7. Del mismo modo, se sabe que el envejecimiento, la diabetes, las infecciones del tracto urinario inferior, la cistitis intersticial y otros procesos de enfermedades que afectan la vejiga urinaria, o el circuito asociado que controla su función, causan disfunción de la vejiga 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17^{, 18,19}. Una mejor comprensión del comportamiento miccional normal y anormal depende del desarrollo de métodos que puedan discriminar de manera confiable entre diferentes patrones de micción.

Tradicionalmente, el comportamiento de micción voluntaria de ratones ha sido estudiado utilizando el ensayo de punto vacío (VSA), desarrollado por Desjardins y colegas 20, y ampliamente adoptado debido a su simplicidad, bajo costo y enfoque no invasivo 8,21,22,23,24. Este ensayo se realiza típicamente como un ensayo de punto final, en el que un ratón pasa una cantidad definida de tiempo en una jaula forrada por un papel de filtro, que posteriormente se analiza contando el número y evaluando el tamaño de las manchas de orina cuando el papel de filtro se coloca bajo luz ultravioleta (UV) (las manchas de orina fluorescen en estas condiciones)²⁰. A pesar de estas muchas ventajas, el VSA tradicional presenta algunas limitaciones importantes. Debido a que los ratones a menudo orinan en las mismas áreas, los investigadores tienen que restringir la duración del ensayo a un período de tiempo relativamente corto (≤4 h)²⁵. Incluso cuando el VSA se realiza durante períodos de tiempo más cortos, es casi imposible resolver pequeños puntos vacíos (SVS) que caen sobre grandes puntos vacíos o discriminar SVS del arrastre de orina adherida a colas o patas. También es muy difícil distinguir si las SVS son consecuencia de eventos miccionales frecuentes pero individuales (fenotipo que a menudo se observa en respuesta a la cistitis ^4,26), o debido al goteo postmiccional (fenotipo asociado a la obstrucción de la salida de la vejiga ²⁷). Además, el deseo de completar el ensayo durante las horas de trabajo, junto con las dificultades para acceder a las instalaciones de vivienda cuando se apagan las luces, a menudo limita estos ensayos al período de luz del ciclo circadiano de 24 h. Por lo tanto, estas limitaciones de tiempo impiden la evaluación del comportamiento miccional del ratón durante su fase nocturna activa, disminuyendo la capacidad de analizar genes específicos o tratamientos que se rigen por ritmos circadianos.

Para superar algunas de estas limitaciones, los investigadores han desarrollado métodos alternativos para evaluar el comportamiento miccional en tiempo real 26,28,29,30,31,32. Algunos de estos enfoques implican el uso de equipos costosos como jaulas metabólicas^26,28,29, o el uso de cámaras térmicas³⁰; Sin embargo, estos también tienen limitaciones. Por ejemplo, en las jaulas metabólicas, la orina tiende a adherirse a los cables del piso de malla y a las paredes del embudo, reduciendo la cantidad de orina que se recolecta y se mide. Por lo tanto, puede ser difícil recopilar con precisión datos sobre pequeños vacíos. Además, las jaulas metabólicas no proporcionan información sobre la distribución espacial de los eventos miccionales (es decir, micción en las esquinas frente al centro de la cámara). Dado que la radiación infrarroja de longitud de onda larga utilizada por las cámaras termográficas no penetra en los sólidos, la actividad miccional evaluada por termografía de video debe realizarse en un sistema abierto, lo que puede ser un desafío con ratones activos, ya que pueden saltar varias pulgadas en el aire. Otro sistema es el enfoque automatizado de tinción en papel (aVSOP)³³, que consiste en papel de filtro enrollado que se enrolla a una velocidad constante debajo del piso de malla de alambre de una jaula para ratones. Este enfoque evita el daño del papel y la superposición de manchas de orina que ocurren en el VSA clásico, y su implementación permite al investigador realizar experimentos durante varios días. Sin embargo, no proporciona al investigador el momento preciso de los eventos de micción, y no hay capacidad para examinar el comportamiento y cómo se correlaciona con la detección. Para obtener esta información, los investigadores han incorporado la videomonitorización a los ensayos de micción, un enfoque que permite la evaluación simultánea de la actividad del ratón y los eventos de micción^31,32. Un enfoque consiste en colocar un diodo emisor de luz azul (LED) y una cámara de video con un filtro de proteína de fluorescencia verde colocado debajo de la jaula experimental para visualizar los eventos de micción, y un LED infrarrojo y una cámara de video sobre la jaula para capturar la posición³² del ratón. Esta configuración se ha utilizado para monitorear el comportamiento de micción mientras se realiza la fotometría de fibra; Sin embargo, el ambiente brillantemente iluminado de este sistema requirió que los investigadores trataran a sus ratones con un agente diurético para estimular la micción. En otro diseño experimental, se colocaron cámaras gran angular por encima y por debajo de la jaula experimental para visualizar la actividad motora del ratón y los eventos de micción, respectivamente. En este caso, las manchas de orina depositadas en un papel de filtro que recubre el piso de la jaula se revelaron iluminando el papel de filtro con luces UV colocadas debajo de la jaula³¹. Esta configuración fue utilizada en ensayos cortos, de 4 min de duración, durante la fase ligera del día para estudiar las neuronas del tronco encefálico involucradas en el comportamiento de micción voluntaria³¹. No se informó la idoneidad de este sistema para su uso durante la fase oscura o por períodos de tiempo >4 min.

En este artículo, se describe un método que mejora el VSA tradicional al permitir el monitoreo de video a largo plazo del comportamiento de vaciado del mouse. Este enfoque rentable proporciona información temporal, espacial y volumétrica sobre eventos miccionales durante largos períodos de tiempo durante las fases de luz y oscuridad del día, junto con detalles relacionados con el comportamiento del ratón ^3,4,34. Se proporciona información detallada para la construcción de las cámaras de vaciación, la implementación de un VSA EN TIEMPO REAL (RT-VSA) y el análisis de los datos. El RT-VSA es valioso para los investigadores que buscan comprender los mecanismos fisiológicos que controlan la función del sistema urinario, desarrollar enfoques farmacológicos para controlar la micción y definir las bases moleculares de los procesos de enfermedad que afectan el tracto urinario inferior.