リアルタイムボイドスポットアッセイ

尿の貯蔵と排尿は、骨盤神経と下腹部神経を介して膀胱充満状態に関する情報を受け取る中枢回路(中枢神経系)によって調整されます。尿路上皮は、尿路を腎盂から近位尿道まで裏打ちする上皮であり、尿中に存在する代謝老廃物や病原体に対する強固な障壁を形成します。これは感覚網の不可欠なコンポーネントであり、膀胱の充満状態を感知して下にある組織や求心性神経に伝えます^1,2。尿路上皮関門の破壊、または尿路上皮メカノトランスダクション経路の変化は、頻度、切迫感、夜間頻尿、失禁などの下部尿路症状とともに排尿機能障害を引き起こす可能性があります^3,4,5,6,7。同様に、老化、糖尿病、下部尿路感染症、間質性膀胱炎、および膀胱に影響を及ぼす他の疾患プロセス、またはその機能を制御する関連回路は、膀胱機能障害を引き起こすことが知られている⁸、^9、10、11、12、13、14、15、¹⁶、^17、18,19。正常な排尿行動と異常な排尿行動のより良い理解は、異なる排尿パターンを確実に区別できる方法の開発に依存します。

伝統的に、マウスの自発的な排尿行動は、Desjardinsら²⁰によって開発されたボイドスポットアッセイ(VSA)を用いて研究され、その単純さ、低コスト、および非侵襲的アプローチのために広く採用されてきた⁸、²¹、22、^23、24。このアッセイは通常、エンドポイントアッセイとして行われ、マウスはろ紙で裏打ちされたケージ内で定義された時間過ごし、その後、ろ紙を紫外線(UV)光の下に置いたときの尿スポットの数を数えてサイズを評価することによって分析されます(尿スポットはこれらの条件下で蛍光を発します)²⁰.これらの多くの利点にもかかわらず、従来のVSAにはいくつかの大きな制限があります。マウスは同じ領域で排尿することが多いため、研究者はアッセイの期間を比較的短い期間(≤4時間)に制限する必要があります²⁵。VSAを短時間で実施したとしても、大きな空洞に落ちる小空洞(SVS)を解消したり、尾や足に付着した尿のキャリーオーバーからSVSを判別したりすることはほとんど不可能です。また、SVSが頻繁ではあるが個々の排尿イベント(膀胱炎に反応してしばしば観察される表現型^4,26)の結果であるか、排尿後のドリブル(膀胱出口閉塞に関連する表現型)によるものかを区別することも非常に困難です²⁷)。さらに、勤務時間中にアッセイを完了したいという願望は、照明がオフのときに住宅施設にアクセスすることの難しさと相まって、これらのアッセイを24時間の概日周期の明期に制限することがよくあります。したがって、これらの時間的制約は、活動的な夜間のマウス排尿行動の評価を妨げ、概日リズムによって支配される特定の遺伝子または治療を分析する能力を低下させます。

これらの制限のいくつかを克服するために、研究者は排尿行動をリアルタイムで評価するための代替方法を開発しました26,28,29,30,31,32。これらのアプローチのいくつかは、メタボリックケージ^26、28、²⁹などの高価な機器の使用^、またはサーマルカメラ³⁰の使用を含む。ただし、これらにも制限があります。例えば、代謝ケージでは、尿はメッシュフロアのワイヤーおよび漏斗の壁に付着する傾向があり、収集および測定される尿の量を減少させる。したがって、小さなボイドに関するデータを正確に収集することは困難な場合があります。さらに、メタボリックケージは、排尿事象の空間分布(すなわち、腔の中心に対する隅の排尿)に関する情報を提供しない。サーモグラフィカメラで使用される長波長赤外線は固体を透過しないことを考えると、ビデオサーモグラフィによって評価される排尿活性は、空中で数インチジャンプする可能性があるため、アクティブなマウスでは困難なオープンシステムで実行する必要があります。別のシステムは、マウスケージの金網の床の下で一定の速度で巻き取られるロール状のろ紙で構成される自動ボイドステインオンペーパー(aVSOP)アプローチ³³です。このアプローチは、古典的なVSAで発生する紙の損傷と尿の斑点の重なりを防ぎ、その実装により、研究者は数日間にわたって実験を行うことができます。ただし、排尿イベントの正確なタイミングを調査員に提供せず、行動とそれがスポッティングとどのように相関しているかを調べる能力はありません。この情報を得るために、研究者らは、マウスの活動と排尿事象の同時評価を可能にするアプローチである排尿アッセイにビデオモニタリングを組み込んだ^31,32。1つのアプローチは、青色発光ダイオード(LED)と緑色蛍光タンパク質フィルターをセットしたビデオカメラを実験ケージの下に配置してボイディングイベントを視覚化し、赤外線LEDとビデオカメラをケージの上に配置してマウスの位置³²をキャプチャすることで構成されます。この設定は、ファイバー測光の実行中に排尿動作を監視するために使用されています。しかし、このシステムの明るく照らされた環境では、研究者はマウスを利尿剤で治療して排尿を刺激する必要がありました。別の実験計画では、広角カメラを実験ケージの上下に設置して、マウスの運動活動と排尿イベントをそれぞれ視覚化しました。この場合、ケージ³¹の下に置かれたUVライトでろ紙を照らすことによって、ケージの床を裏打ちするろ紙に堆積した尿斑が明らかになった。このセットアップは、自発的な排尿行動に関与する脳幹ニューロンを研究するために、その日の明期に4分間の短いアッセイで使用されました³¹。暗期または>4分の期間の使用に対するこのシステムの適合性は報告されていません。

この記事では、マウスの排尿動作を長期間ビデオで監視できるようにすることで、従来のVSAを強化する方法について説明します。この費用対効果の高いアプローチは、マウスの行動に関連する詳細とともに、一日の明期と暗期の間の^{長時間の排}尿イベントに関する時間的、空間的、および体積情報を提供します3^、4、34。ボイディングチャンバーの建設、リアルタイムVSA(RT-VSA)の実装、およびデータの分析に関する詳細情報が提供されます。RT-VSAは、泌尿器系の機能を制御する生理学的メカニズムを理解し、排尿を制御するための薬理学的アプローチを開発し、下部尿路に影響を与える疾患プロセスの分子基盤を定義しようとしている研究者にとって価値があります。