מאמר זה מתאר שיטה חדשה לחקר התנהגות התרוקנות עכבר על-ידי שילוב ניטור וידאו בבדיקת נקודות הריק הקונבנציונלית. גישה זו מספקת מידע זמני, מרחבי ונפחי על אירועי ההתרוקנות ופרטים על התנהגות עכברים במהלך שלבי האור והחושך של היום.
התנהגות התרוקנות נורמלית היא תוצאה של תפקוד מתואם של שלפוחית השתן, השופכה וסוגרי השופכה תחת שליטה נכונה של מערכת העצבים. כדי לחקור התנהגות של התרוקנות מרצון במודלים של עכברים, חוקרים פיתחו את בדיקת נקודות הריק (VSA), שיטה המודדת את מספר ושטח כתמי השתן שהושקעו על נייר סינון המצפה את רצפת הכלוב של בעל חיים. למרות שמבחינה טכנית היא פשוטה וזולה, לבדיקה זו יש מגבלות כאשר משתמשים בה כבדיקת נקודת קצה, כולל חוסר רזולוציה זמנית של אירועי התרוקנות וקשיים בכימות כתמי שתן חופפים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו VSA מנוטר וידאו, שאנו מכנים VSA בזמן אמת (RT-VSA), ואשר מאפשר לנו לקבוע את תדירות ההתרוקנות, להעריך את הנפח המבוטל ואת דפוסי ההתרוקנות, ולבצע מדידות על פני חלונות זמן של 6 שעות הן בשלב החשוך והן בשלב האור של היום. השיטה המתוארת בדו”ח זה יכולה להיות מיושמת במגוון רחב של מחקרים מבוססי עכברים הבוחנים את ההיבטים הפיזיולוגיים והנוירו-התנהגותיים של מיקוריטציה מרצון במצבי בריאות ומחלות.
אחסון השתן והמיקטוריציה מתואמים על ידי מעגל מרכזי (מערכת העצבים המרכזית) המקבל מידע על מצב מילוי שלפוחית השתן דרך עצבי האגן וההיפוקיבה. האורותל, האפיתל המרפד את דרכי השתן מאגן הכליה ועד לשופכה הפרוקסימלית, יוצר מחסום הדוק בפני תוצרי הפסולת המטבולית והפתוגנים הנמצאים בשתן. זהו מרכיב אינטגרלי של רשת חושים, אשר חשה ומתקשרת את מצב המילוי של שלפוחית השתן לרקמות הבסיסיותולעצבים 1,2. הפרעה במחסום דרכי השתן, או שינויים במסלולי המכנוטרנסדוקציה של דרכי השתן, עלולה להוביל לתפקוד לקוי של התרוקנות יחד עם תסמינים בדרכי השתן התחתונות כגון תדירות, דחיפות, נוקטוריה ובריחת שתן 3,4,5,6,7. כמו כן, הזדקנות, סוכרת, דלקות בדרכי השתן התחתונות, דלקת שלפוחית השתן אינטרסטיציאלית ותהליכי מחלה אחרים המשפיעים על שלפוחית השתן, או על המעגלים החשמליים הקשורים השולטים בתפקודה, ידועים כגורמים לתפקוד לקוי של שלפוחית השתן 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. הבנה טובה יותר של התנהגות התרוקנות נורמלית וחריגה תלויה בפיתוח שיטות שיכולות להבחין באופן אמין בין דפוסי השתנה שונים.
באופן מסורתי, התנהגות ההתרוקנות מרצון של עכברים נחקרה באמצעות בדיקת נקודת הריק (VSA), שפותחה על ידי Desjardins ועמיתיו 20, ואומצה באופן נרחב בשל פשטותה, עלותה הנמוכה והגישה הלא פולשנית 8,21,22,23,24. בדיקה זו מבוצעת בדרך כלל כבדיקת נקודות קצה, שבה עכבר מבלה פרק זמן מוגדר בכלוב מרופד בנייר סינון, אשר מנותח לאחר מכן על ידי ספירת המספר והערכת גודל כתמי השתן כאשר נייר הסינון ממוקם תחת אור אולטרה סגול (UV) (כתמי השתן פלואורס בתנאים אלה)20. למרות יתרונות רבים אלה, VSA המסורתי מציג כמה מגבלות עיקריות. מכיוון שעכברים משתינים לעתים קרובות באותם אזורים, החוקרים צריכים להגביל את משך הבדיקה לפרק זמן קצר יחסית (≤4 שעות)25. אפילו כאשר ה-VSA מבוצע על פני פרקי זמן קצרים יותר, כמעט בלתי אפשרי לפתור כתמי ריק קטנים (SVS) הנופלים על כתמי ריק גדולים או, להבדיל בין SVS לבין נשיאת שתן המודבקת לזנבות או לכפות. כמו כן, קשה מאוד להבחין אם SVS הם תוצאה של אירועי התרוקנות תכופים אך אינדיבידואליים (פנוטיפ שנצפה לעתים קרובות בתגובה לדלקת שלפוחית השתן 4,26), או עקב כדרור לאחר מיקטוריציה (פנוטיפ הקשור לחסימת מוצא שלפוחית השתן 27). יתר על כן, הרצון להשלים את הבדיקה במהלך שעות העבודה, יחד עם קשיים בגישה למתקני דיור כאשר האורות כבויים, לעתים קרובות מגביל בדיקות אלה לתקופת האור של מחזור הצירקדי 24 שעות. לפיכך, אילוצי זמן אלה מונעים הערכה של התנהגות התרוקנות עכברים במהלך שלב הלילה הפעיל שלהם, ומפחיתים את היכולת לנתח גנים או טיפולים ספציפיים הנשלטים על ידי מקצבים צירקדיים.
כדי להתגבר על חלק מהמגבלות הללו, חוקרים פיתחו שיטות חלופיות להערכת התנהגות ההתרוקנות בזמן אמת 26,28,29,30,31,32. חלק מגישות אלה כוללות שימוש בציוד יקר כגון כלובים מטבוליים26,28,29, או שימוש במצלמות תרמיות30; עם זאת, גם לאלה יש מגבלות. לדוגמה, בכלובים מטבוליים, השתן נוטה להיצמד לחוטי רצפת הרשת ולקירות המשפך, ובכך להפחית את כמות השתן הנאסף ונמדד. לכן, זה יכול להיות קשה לאסוף במדויק נתונים על חללים קטנים. יתר על כן, כלובים מטבוליים אינם מספקים מידע על ההתפלגות המרחבית של אירועי ההתרוקנות (כלומר, השתנה בפינות לעומת מרכז החדר). בהתחשב בכך שקרינת אינפרא אדום באורך גל ארוך המשמשת את המצלמות התרמוגרפיות אינה חודרת למוצקים, פעילות ההתרוקנות המוערכת על ידי תרמוגרפיית וידאו חייבת להתבצע במערכת פתוחה, מה שיכול להיות מאתגר עם עכברים פעילים, מכיוון שהם יכולים לקפוץ כמה סנטימטרים באוויר. מערכת נוספת היא שיטת הכתם המבוטל האוטומטי על נייר (aVSOP) בגישה33, המורכבת מנייר סינון מגולגל המתפתל במהירות קבועה מתחת לרצפת רשת התיל של כלוב עכבר. גישה זו מונעת נזק לנייר וחפיפה של כתמי שתן המתרחשים ב- VSA הקלאסי, ויישומה מאפשר לחוקר לבצע ניסויים במשך מספר ימים. עם זאת, היא אינה מספקת לחוקר תזמון מדויק של אירועי ההתרוקנות, ואין יכולת לבחון התנהגות וכיצד היא קשורה לאיתור. כדי להשיג מידע זה, החוקרים שילבו ניטור וידאו לבדיקות ריקות, גישה המאפשרת הערכה בו זמנית של פעילות עכבר ואירועי השתנה31,32. גישה אחת כוללת הצבת דיודה פולטת אור כחול (LED) ומצלמת וידאו עם מסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק המוצב מתחת לכלוב הניסוי כדי להמחיש את אירועי ההתרוקנות, ונורית אינפרא אדום ומצלמת וידאו מעל הכלוב כדי ללכוד את מיקום העכבר32. מערך זה שימש לניטור התנהגות התרוקנות בעת ביצוע פוטומטריית סיבים; עם זאת, הסביבה המוארת של מערכת זו דרשה מהחוקרים לטפל בעכברים שלהם עם חומר משתן כדי לעורר התרוקנות. בתכנון ניסיוני אחר, מצלמות רחבות זווית הוצבו מעל ומתחת לכלוב הניסוי כדי להמחיש פעילות מוטורית של עכבר ואירועי השתנה, בהתאמה. במקרה זה, כתמי שתן שהושקעו על נייר סינון המצפה את רצפת הכלוב נחשפו על ידי הארת נייר הסינון באורות UV שהונחו מתחת לכלוב31. מערך זה שימש בבדיקות קצרות, שנמשכו 4 דקות, במהלך שלב האור של היום כדי לחקור את נוירוני גזע המוח המעורבים בהתנהגות התרוקנות מרצון31. לא דווח על התאמת מערכת זו לשימוש בה בשלב החשוך או לפרקי זמן של >4 דקות.
במאמר זה מתוארת שיטה המשפרת את ה- VSA המסורתי בכך שהיא מאפשרת ניטור וידאו ארוך טווח של התנהגות ריקון עכבר. גישה חסכונית זו מספקת מידע זמני, מרחבי ונפחי על אירועי התרוקנות לפרקי זמן ממושכים במהלך שלבי האור והחושך של היום, יחד עם פרטים הקשורים להתנהגות עכבר 3,4,34. מידע מפורט לבניית תאי הריקות, יישום VSA בזמן אמת (RT-VSA) וניתוח הנתונים מסופק. RT-VSA הוא בעל ערך עבור חוקרים המבקשים להבין את המנגנונים הפיזיולוגיים השולטים בתפקוד מערכת השתן, לפתח גישות פרמקולוגיות לבקרת מיקטוריציה, ולהגדיר את הבסיס המולקולרי של תהליכי מחלה המשפיעים על דרכי השתן התחתונות.
שילוב של ניטור וידאו הוא שינוי חסכוני המציג מספר יתרונות על פני VSA קלאסי. ב- VSA הקלאסי, המשמש בדרך כלל כבדיקת נקודת קצה, קשה להבחין בין נקודות ריק חופפות. זה לא עניין של מה בכך, שכן עכברים נוטים להשתין מספר פעמים באותו אזור כאשר הבדיקה ממושכת למספר שעות, בדרך כלל בפינות הכלוב שלהם. לפיכך, היתרו?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי R01DK119183 מענק NIH (ל- G.A. ו- MDC), פרס פרויקט פיילוט באמצעות P30DK079307 (ל- M.G.D.), פרס פיתוח קריירה של האגודה האמריקאית לאורולוגיה ומענק קרן וינטרס (ל- N.M.), ועל ידי ליבות הדמיית כליות של פיזיולוגיה של התא ואורגניזמים מודל של מרכז פיטסבורג לחקר הכליות (P30DK079307).
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 10 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 20 |
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 12 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 6 |
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 40 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 4 |
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 12 |
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 32 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 5 |
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3280 | Amount: 16 |
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3287 | Amount: 18 |
10 & 25 Series 2 Hole – 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support | 80/20 | 14061 | Amount: 6 |
10 Series 3 Hole – Straight Flat Plate | 80/20 | 4118 | Amount: 8 |
10 Series 5 Hole – "L" Flat Plate | 80/20 | 4081 | Amount: 8 |
10 Series 5 Hole – "T" Flat Plate | 80/20 | 4080 | Amount: 8 |
10 Series 5 Hole – Tee Flat Plate | 80/20 | 4140 | Amount: 2 |
10 Series Standard Lift-Off Hinge – Right Hand Assembly | 80/20 | 2064 | Amount: 2 |
10 to 15 Series 2 Hole – Lite Transition Inside Corner Bracket | 80/20 | 4509 | Amount: 6 |
24”-long UV tube lights | ADJ Products LLC | T8-F20BLB24 | Amount: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm |
Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 1 82.5 cm x 26.5 cm |
|
Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 26.5 cm X 30.5 cm |
|
Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 82.5 cm x 30.5 cm |
|
AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm |
AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm |
AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm |
AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm |
AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm |
Chromatography paper (thin paper) | Thermo Fisher Scientific | 57144 | |
Cosmos blotting paper (thick paper) | Blick Art Materials | 10422-1005 | |
Excel | Microsoft Corporation | ||
GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9.4.0 | graphing and statistics software |
ImageJ FIJI | NIH | ||
Parafilm | Merck | transparent film | |
Quick Time Player 10.5 software | Apple | multimedia player | |
Security spy | Ben software | video surveillance software system | |
Standard End Fastener, 1/4-20 | 80/20 | 3381 | Amount: 80 |
UV transmitting acrylic | Spartech | Polycast Solacryl SUVT | Amount: 2 38.5 cm x 26.5 cm |
Water gel: HydroGel | ClearH2O | 70-01-5022 | (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/) |
Webcam | Logitech | C930e | Amount: 4 |