Saggio spot del vuoto in tempo reale

La conservazione delle urine e la minzione sono coordinate da un circuito centrale (sistema nervoso centrale) che riceve informazioni sullo stato di riempimento della vescica attraverso i nervi pelvico e ipogastrico. L’urotelio, l’epitelio che riveste il tratto urinario dalla pelvi renale all’uretra prossimale, forma una stretta barriera ai prodotti di scarto metabolici e agli agenti patogeni presenti nelle urine. È parte integrante di una rete sensoriale, che rileva e comunica lo stato di riempimento della vescica ai tessuti sottostanti e ai nervi afferenti ^1,2. La rottura della barriera uroteliale, o alterazioni nelle vie di meccanotrasduzione uroteliale, possono portare a disfunzioni minzionali insieme a sintomi del tratto urinario inferiore come frequenza, urgenza, nicturia e incontinenza 3,4,5,6,7. Allo stesso modo, l’invecchiamento, il diabete, le infezioni del tratto urinario inferiore, la cistite interstiziale e altri processi patologici che colpiscono la vescica urinaria o i circuiti associati che controllano la sua funzione, sono noti per causare disfunzione della vescica 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17^{, 18,19}. Una migliore comprensione del comportamento minzionale normale e anormale dipende dallo sviluppo di metodi che possono discriminare in modo affidabile tra diversi modelli di minzione.

Tradizionalmente, il comportamento di minzione volontaria dei topi è stato studiato utilizzando il void spot assay (VSA), sviluppato da Desjardins e colleghi²⁰, e ampiamente adottato grazie alla sua semplicità, basso costo e approccio non invasivo 8,21,22,23,24. Questo test viene tipicamente eseguito come test finale, in cui un topo trascorre una quantità definita di tempo in una gabbia rivestita da una carta da filtro, che viene successivamente analizzata contando il numero e valutando la dimensione delle macchie di urina quando la carta da filtro viene posta sotto luce ultravioletta (UV) (le macchie di urina sono fluorescenti in queste condizioni)²⁰. Nonostante questi numerosi vantaggi, il VSA tradizionale presenta alcune importanti limitazioni. Poiché i topi spesso urinano nelle stesse aree, i ricercatori devono limitare la durata del test a un periodo di tempo relativamente breve (≤4 ore)²⁵. Anche quando il VSA viene eseguito su periodi di tempo più brevi, è quasi impossibile risolvere piccoli punti vuoti (SVS) che cadono su grandi macchie vuote o, per discriminare le SVS dal trascinamento di urina aderente alla coda o alle zampe. È anche molto difficile distinguere se le SVS sono una conseguenza di frequenti ma singoli eventi minzionali (un fenotipo che si osserva spesso in risposta alla cistite ^4,26), o a causa del dribbling post-minzione (un fenotipo associato all’ostruzione dello sbocco della vescica²⁷). Inoltre, il desiderio di completare il test durante l’orario di lavoro, unito alle difficoltà di accesso alle strutture abitative quando le luci sono spente, spesso limita questi test al periodo di luce del ciclo circadiano di 24 ore. Pertanto, questi vincoli temporali impediscono la valutazione del comportamento minzionale del topo durante la loro fase notturna attiva, diminuendo la capacità di analizzare geni o trattamenti specifici che sono governati dai ritmi circadiani.

Per superare alcune di queste limitazioni, i ricercatori hanno sviluppato metodi alternativi per valutare il comportamento minzionale in tempo reale 26,28,29,30,31,32. Alcuni di questi approcci prevedono l’uso di attrezzature costose come le gabbie metaboliche^26,28,29 o l’uso di telecamere termiche³⁰; Tuttavia, anche questi hanno dei limiti. Ad esempio, nelle gabbie metaboliche, l’urina tende ad aderire ai fili del pavimento della rete e alle pareti dell’imbuto, riducendo la quantità di urina che viene raccolta e misurata. Pertanto, può essere difficile raccogliere con precisione dati su piccoli vuoti. Inoltre, le gabbie metaboliche non forniscono informazioni sulla distribuzione spaziale degli eventi di minzione (cioè la minzione negli angoli rispetto al centro della camera). Dato che la radiazione infrarossa a lunga lunghezza d’onda utilizzata dalle telecamere termografiche non penetra i solidi, l’attività di svuotamento valutata dalla videotermografia deve essere eseguita in un sistema aperto, che può essere difficile con i topi attivi, in quanto possono saltare diversi centimetri nell’aria. Un altro sistema è l’approccio automatizzato aVSOP (automated voided stain on paper)³³, che consiste in carta da filtro arrotolata che si avvolge a velocità costante sotto il pavimento in rete metallica di una gabbia per topi. Questo approccio previene i danni alla carta e la sovrapposizione di macchie di urina che si verificano nel VSA classico e la sua implementazione consente allo sperimentatore di eseguire esperimenti per diversi giorni. Tuttavia, non fornisce allo sperimentatore una tempistica precisa degli eventi di minzione e non vi è alcuna capacità di esaminare il comportamento e come si correla con lo spotting. Per ottenere queste informazioni, i ricercatori hanno incorporato il video-monitoraggio ai saggi di minzione, un approccio che consente la valutazione simultanea dell’attività del topo e degli eventi di minzione^31,32. Un approccio consiste nel posizionare un diodo a emissione di luce blu (LED) e una videocamera con un filtro proteico a fluorescenza verde posto sotto la gabbia sperimentale per visualizzare gli eventi di svuotamento, e un LED a infrarossi e una videocamera sopra la gabbia per catturare la posizione del mouse³². Questa configurazione è stata utilizzata per monitorare il comportamento dello svuotamento durante l’esecuzione della fotometria delle fibre; Tuttavia, l’ambiente illuminato di questo sistema ha richiesto ai ricercatori di trattare i loro topi con un agente diuretico per stimolare la minzione. In un altro progetto sperimentale, le telecamere grandangolari sono state posizionate sopra e sotto la gabbia sperimentale per visualizzare rispettivamente l’attività motoria del topo e gli eventi di minzione. In questo caso, le macchie di urina depositate su una carta da filtro che riveste il pavimento della gabbia sono state rivelate illuminando la carta da filtro con luci UV poste sotto la gabbia³¹. Questa configurazione è stata utilizzata in saggi brevi, della durata di 4 minuti, durante la fase luminosa del giorno per studiare i neuroni del tronco cerebrale coinvolti nel comportamento di minzione volontaria³¹. L’idoneità di questo sistema per il suo utilizzo durante la fase di buio o per periodi di tempo >4 minuti non è stata riportata.

In questo articolo viene descritto un metodo che migliora il VSA tradizionale consentendo il monitoraggio video a lungo termine del comportamento di svuotamento del mouse. Questo approccio economico fornisce informazioni temporali, spaziali e volumetriche sugli eventi di svuotamento per lunghi periodi di tempo durante le fasi di luce e buio del giorno, insieme a dettagli relativi al comportamento del mouse ^3,4,34. Vengono fornite informazioni dettagliate per la costruzione delle camere di svuotamento, l’implementazione di un VSA (RT-VSA) in tempo reale e l’analisi dei dati. L’RT-VSA è prezioso per i ricercatori che cercano di comprendere i meccanismi fisiologici che controllano la funzione del sistema urinario, per sviluppare approcci farmacologici per controllare la minzione e per definire le basi molecolari dei processi patologici che colpiscono il tratto urinario inferiore.