실시간 보이드 스팟 어세이
Summary
이 기사에서는 기존의 공극 스팟 분석에 비디오 모니터링을 통합하여 마우스 배뇨 거동을 연구하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 보이드 이벤트에 대한 시간적, 공간적, 체적 정보와 낮의 밝고 어두운 단계 동안 마우스 동작의 세부 정보를 제공합니다.
Abstract
정상적인 배뇨 행동은 신경계의 적절한 제어 하에 방광, 요도 및 요도 괄약근의 조정된 기능의 결과입니다. 마우스 모델에서 자발적인 배뇨 행동을 연구하기 위해 연구자들은 동물 케이지 바닥을 감싸는 여과지에 퇴적된 소변 반점의 수와 면적을 측정하는 방법인 공극 반점 분석(VSA)을 개발했습니다. 기술적으로 간단하고 저렴하지만 이 분석은 배뇨 사건의 시간적 분해능 부족과 겹치는 소변 반점을 정량화하는 데 어려움을 포함하여 종말점 분석으로 사용할 때 한계가 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 실시간 VSA(RT-VSA)라고 하는 비디오 모니터링 VSA를 개발했으며, 이를 통해 보이드 주파수를 결정하고, 보이드 볼륨 및 보이드 패턴을 평가하고, 낮의 어두운 단계와 밝은 단계 모두에서 6시간 동안 측정할 수 있습니다. 이 보고서에 설명된 방법은 건강 및 질병 상태에서 자발적인 배뇨의 생리학적 및 신경행동적 측면을 탐구하는 다양한 마우스 기반 연구에 적용할 수 있습니다.
Introduction
소변 저장과 배뇨는 골반 및 하복부 신경을 통해 방광 충전 상태에 대한 정보를 수신하는 중추 회로(중추 신경계)에 의해 조정됩니다. 신장 골반에서 근위 요도까지 요로를 둘러싸고 있는 상피인 요로상피는 소변에 존재하는 대사 노폐물과 병원체에 대한 단단한 장벽을 형성합니다. 이것은 방광의 충전 상태를 감지하고 기저 조직과 구심성 신경에 전달하는 감각 웹의 필수 구성 요소입니다 1,2. 요로상피막의 파괴 또는 요로상피기계 전달 경로의 변화는 빈뇨, 절박뇨, 야뇨증, 요실금과 같은 하부 요로 증상과 함께 배뇨 기능 장애를 유발할 수 있다 3,4,5,6,7. 마찬가지로, 노화, 당뇨병, 하부 요로 감염, 간질성 방광염, 및 방광 또는 그 기능을 조절하는 관련 회로에 영향을 미치는 다른 질병 과정은 방광 기능 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. 정상 및 비정상 배뇨 행동에 대한 더 나은 이해는 다양한 배뇨 패턴을 안정적으로 구별할 수 있는 방법의 개발에 달려 있습니다.
전통적으로, 마우스의 자발적인 배뇨 거동은 데자르뎅(Desjardins)과 동료들에 의해 개발된 공극 반점 분석(void spot assay, VSA)을 사용하여 연구되어 왔으며20, 그 단순성, 저비용, 비침습적 접근법으로 인해 널리 채택되었다 8,21,22,23,24. 이 분석은 일반적으로 종말점 분석으로 수행되며, 마우스는 여과지가 늘어선 케이지에서 정의된 시간을 보내고, 이후 여과지를 자외선(UV) 광선(이러한 조건에서 소변 반점이 형광을 발함) 아래에 놓았을 때 소변 반점의 수를 세고 크기를 평가하여 분석합니다.20. 이러한 많은 장점에도 불구하고 기존 VSA에는 몇 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 생쥐는 종종 같은 부위에서 소변을 보기 때문에 연구자는 분석 기간을 비교적 짧은 시간(≤4시간)으로 제한해야 합니다25. VSA가 더 짧은 기간에 걸쳐 수행되더라도 큰 공극 반점 위로 떨어지는 작은 공극 반점(SVS)을 해결하거나 꼬리나 발에 부착된 소변의 이월과 SVS를 구별하는 것은 거의 불가능합니다. 또한 SVS가 빈번하지만 개별적인 배뇨 사건(방광염에 대한 반응으로 종종 관찰되는 표현형)의 결과인지 아니면 배뇨 후 드리블(방광출구 폐쇄와 관련된 표현형)의 결과인지 구별하는 것도 매우 어렵습니다27). 또한, 근무 시간 동안 분석을 완료하려는 욕구와 조명이 꺼졌을 때 주거 시설에 접근하는 데 어려움이 있기 때문에 이러한 분석은 종종 24시간 일주기 주기의 조명 기간으로 제한됩니다. 따라서 이러한 시간 제약은 활성 야간 단계에서 마우스 배뇨 행동의 평가를 방해하여 일주기 리듬에 의해 제어되는 특정 유전자 또는 치료법을 분석하는 능력을 감소시킵니다.
이러한 한계 중 일부를 극복하기 위해 연구자들은 실시간으로 배뇨 거동을 평가하는 대체 방법을 개발했습니다 26,28,29,30,31,32. 이러한 접근법 중 일부는 대사 케이지(26, 28, 29)와 같은 고가의 장비의 사용 또는 열화상 카메라(30)의 사용을 포함한다; 그러나 이것들 역시 한계가 있습니다. 예를 들어, 대사 케이지에서 소변은 메쉬 바닥의 와이어와 깔때기 벽에 달라붙는 경향이 있어 수집 및 측정되는 소변의 양을 줄입니다. 따라서 작은 공극에 대한 데이터를 정확하게 수집하기 어려울 수 있습니다. 또한, 대사 케이지는 배뇨 사건의 공간적 분포(즉, 모서리 대 챔버 중앙의 배뇨)에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 열화상 카메라에서 사용하는 장파장 적외선이 고체를 투과하지 않는다는 점을 감안할 때, 비디오 열화상 촬영으로 평가한 공극 활동은 개방형 시스템에서 수행해야 하며, 이는 활성 마우스가 공중에서 몇 인치를 점프할 수 있기 때문에 어려울 수 있습니다. 또 다른 시스템은 aVSOP(Automated voided stain on paper) 접근법(33)이며, 이는 마우스 케이지의 철망 바닥 아래에서 일정한 속도로 감겨 있는 압연 여과지로 구성된다. 이 접근법은 종이 손상과 고전적인 VSA에서 발생하는 소변 반점의 겹침을 방지하며, 이를 구현하여 조사자가 며칠 동안 실험을 수행할 수 있도록 합니다. 그러나 조사관에게 배뇨 사건의 정확한 시기를 제공하지 않으며 행동 및 그것이 스포팅과 어떤 관련이 있는지 조사할 수 있는 능력이 없습니다. 이 정보를 얻기 위해, 연구자들은 마우스 활동과 배뇨 사건을 동시에 평가할 수 있는 접근법인 배뇨 분석에 비디오 모니터링을 통합했다31,32. 한 가지 접근법은 청색 발광 다이오드(LED) 및 녹색 형광 단백질 필터 세트를 갖는 비디오-카메라를 실험 케이지 아래에 배치하여 보이드 이벤트를 시각화하고, 적외선 LED 및 비디오-카메라를 케이지 위에 배치하여 마우스 위치(32)를 캡처하는 것으로 구성된다. 이 설정은 섬유 측광을 수행하는 동안 보이드 거동을 모니터링하는 데 사용되었습니다. 그러나 이 시스템의 밝은 조명 환경에서는 조사관이 배뇨를 자극하기 위해 이뇨제로 마우스를 치료해야 했습니다. 또 다른 실험 설계에서는 광각 카메라를 실험 케이지 위와 아래에 배치하여 마우스 운동 활동과 배뇨 이벤트를 각각 시각화했습니다. 이 경우, 케이지 바닥을 라이닝하는 여과지 상에 침착된 소변 반점은 케이지(31) 아래에 배치된 UV 광으로 여과지를 조명함으로써 드러났다. 이 설정은 자발적인 배뇨 행동31에 관여하는 뇌간 뉴런을 연구하기 위해 하루 중 가벼운 단계 동안 4분 동안 짧은 분석에 사용되었습니다. 암흑기 동안 또는 >4분 동안 사용하기 위한 이 시스템의 적합성은 보고되지 않았습니다.
이 기사에서는 마우스 보이드 동작에 대한 장기 비디오 모니터링을 허용하여 기존 VSA를 향상시키는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 비용 효율적인 접근법은 마우스 행동(3,4,34)과 관련된 세부사항과 함께, 하루의 밝은 단계와 어두운 단계 동안 연장된 기간 동안 이벤트 무효화에 대한 시간적, 공간적, 체적 정보를 제공한다. 보이드 챔버의 구성, 실시간 VSA(RT-VSA)의 구현 및 데이터 분석에 대한 자세한 정보가 제공됩니다. RT-VSA는 비뇨기계의 기능을 제어하는 생리학적 메커니즘을 이해하고, 배뇨를 조절하기 위한 약리학적 접근법을 개발하고, 하부 요로에 영향을 미치는 질병 과정의 분자적 기초를 정의하려는 연구자에게 유용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
비디오 모니터링의 통합은 기존 VSA에 비해 몇 가지 이점을 제공하는 비용 효율적인 수정입니다. 일반적으로 종말점 분석으로 사용되는 기존 VSA에서는 겹치는 공극 지점을 구별하기가 어렵습니다. 마우스는 일반적으로 케이지 모서리에서 몇 시간 동안 분석이 연장될 때 같은 영역에서 여러 번 소변을 보는 경향이 있기 때문에 이것은 사소한 문제가 아닙니다. 따라서, RT-VSA의 첫 번째 이점은 조사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH 보조금 R01DK119183(GA 및 MDC), P30DK079307(MGD)를 통한 파일럿 프로젝트 상, 미국 비뇨기과 협회 경력 개발 상 및 Winters 재단 보조금(NM), 피츠버그 신장 연구 센터(P30DK079307)의 세포 생리학 및 모델 유기체 신장 이미징 코어.
Materials
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 10 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 20 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 12 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 6 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 40 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 4 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 12 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 32 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 5 |
| 1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3280 | Amount: 16 |
| 1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3287 | Amount: 18 |
| 10 & 25 Series 2 Hole – 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support | 80/20 | 14061 | Amount: 6 |
| 10 Series 3 Hole – Straight Flat Plate | 80/20 | 4118 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole – "L" Flat Plate | 80/20 | 4081 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole – "T" Flat Plate | 80/20 | 4080 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole – Tee Flat Plate | 80/20 | 4140 | Amount: 2 |
| 10 Series Standard Lift-Off Hinge – Right Hand Assembly | 80/20 | 2064 | Amount: 2 |
| 10 to 15 Series 2 Hole – Lite Transition Inside Corner Bracket | 80/20 | 4509 | Amount: 6 |
| 24”-long UV tube lights | ADJ Products LLC | T8-F20BLB24 | Amount: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm |
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 1 82.5 cm x 26.5 cm |
|
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 26.5 cm X 30.5 cm |
|
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 82.5 cm x 30.5 cm |
|
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm |
| Chromatography paper (thin paper) | Thermo Fisher Scientific | 57144 | |
| Cosmos blotting paper (thick paper) | Blick Art Materials | 10422-1005 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9.4.0 | graphing and statistics software |
| ImageJ FIJI | NIH | ||
| Parafilm | Merck | transparent film | |
| Quick Time Player 10.5 software | Apple | multimedia player | |
| Security spy | Ben software | video surveillance software system | |
| Standard End Fastener, 1/4-20 | 80/20 | 3381 | Amount: 80 |
| UV transmitting acrylic | Spartech | Polycast Solacryl SUVT | Amount: 2 38.5 cm x 26.5 cm |
| Water gel: HydroGel | ClearH2O | 70-01-5022 | (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/) |
| Webcam | Logitech | C930e | Amount: 4 |
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