ייצור רקמות חזק לתרבית ארוכת טווח של אורגנואידים במוח שמקורם ב- iPSC לחקר ההזדקנות
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מספק הליך שלב אחר שלב לייצור, תחזוקה והזדקנות הניתנים לשכפול של אורגנואידים מוחיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם (iPSCs). שיטה זו מאפשרת גידול והבשלה של אורגנואידים מוחיים לתקופות ממושכות, מה שמקל על מידול תהליכים המעורבים בהזדקנות המוח ובפתוגנזה הקשורה לגיל.
Abstract
המודלים הקיימים כיום בבעלי חיים ובתאים אינם משקפים באופן מלא את מורכבות השינויים המתרחשים במוח האנושי המזדקן. פיתוח עדכני של נהלים המתארים את הדור של אורגנואידים מוחיים אנושיים, שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs), הוא בעל פוטנציאל לשנות באופן יסודי את היכולת למדל ולהבין את הזדקנות המוח האנושי ותהליכים פתוגניים קשורים. כאן, מוצג פרוטוקול אופטימלי ליצירה, תחזוקה, הזדקנות ואפיון אורגנואידים מוחיים אנושיים שמקורם ב- iPSC. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי ליצור אורגנואידים במוח באופן הניתן לשחזור ומשמש כמדריך שלב אחר שלב, המשלב את הטכניקות העדכניות ביותר שמביאות להתבגרות אורגנואידים משופרת והזדקנות בתרבית. נושאים ספציפיים הקשורים להבשלת אורגנואידים, נמק, השתנות והשפעות אצווה מטופלות. יחד, פיתוחים טכנולוגיים אלה יאפשרו מידול של הזדקנות המוח באורגנואידים שמקורם במגוון תורמים אנושיים צעירים ומבוגרים, כמו גם אנשים הסובלים מהפרעות מוחיות הקשורות לגיל, ויאפשרו זיהוי מנגנונים פיזיולוגיים ופתוגניים של הזדקנות המוח האנושי.
Introduction
מודלים של מחלות הזדקנות הפכו רלוונטיים יותר ויותר ככל שתוחלת החיים האנושית ממשיכה לעלות. מחקרים גנומיים בקנה מידה גדול חשפו אוכלוסיות מבוגרות עם חוסר ויסות של תהליכים מולקולריים ושינויים גנטיים המשפיעים על איכות החיים1. תהליך ההזדקנות מאופיין באובדן כללי של התפקוד של האורגניזם, כולל אובדן תפקוד קוגניטיבי, סיכון מוגבר להפרעות נוירודגנרטיביות, ושורה של מחלות כרוניות2.
טכניקות תרבית התאים הנוכחיות אינן מייצגות כראוי את האופי הרב-גורמי של ההזדקנות, מכיוון שלא ניתן לשכפל כראוי תפקודים אלה באמצעות מוטציות, רעלים או זיהומים3. מודלים של בעלי חיים החוקרים את תהליך ההזדקנות קשורים לעתים קרובות לזמני ניסוי ארוכים ולעלויות גבוהות, אך גם מביאים איתם שיקולים אתיים. שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) מחולים יכול להבהיר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התקדמות המחלה, שכן תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מאפשרים התפתחות טבעית של תאים לרקמה בוגרת3. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הפכו לסוס העבודה של מעבדות רבות החוקרות הפרעות נוירודגנרטיביות, שכן נראה כי תכנות מחדש של תאים שנקטפו אינו מוחק את המחלה או את טביעות ההזדקנות של התורמים4. טביעות אלה משחזרות פנוטיפים תאיים שהודגמו במודלים של בני אדם ובעלי חיים, מה שהופך את תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למתאימים לבחינת הידרדרות תאית אינדיבידואלית של רקמת המוח הצפופה מאוד 5,6. אורגנואידים שמקורם ב-IPSC הפכו למודל המוביל לתרבית תלת-ממדית של רקמות, ומאפשרים אינטראקציות מורכבות יותר בין תאים ושחזור התפתחותי משופר. למרות שאורגנואידים משמשים בעיקר לנתונים התפתחותיים, אורגנואידים מיושמים יותר ויותר במידול מחלות, במיוחד מודלים לדלקת, ניוון עצבי והזדקנות7. בהתבסס על מחקרי iPSC קודמים, אורגנואידים שומרים על פנוטיפים של מחלות ופנוטיפים תאיים בהקשר הפיזיולוגי של חיבורי רשת דמויי רקמות 8,9. עם זאת, גידול רקמה תלת ממדית בממדים מסוימים יכול להיות מאתגר, במיוחד לפרקי זמן ממושכים.
עבודה זו מציגה שיטה מפורטת לייצור מחדש של אורגנואידים מוחיים המאפשרת לרקמה להבשיל באופן משמעותי בגודלה לתקופות ארוכות יותר. יצירת אורגנואידים מוחיים נותרה סטנדרטית יחסית, ואימצה שיטות מכמה פרוטוקולים בולטים10,11. עם זאת, הוצעו מספר שינויים לשיפור הבידול והתחזוקה. שיטות חלופיות אלה כוללות שימוש בגורמים נוירוגניים לשיפור התמיינות עצבית12, פיגומים נוספים לשיפור חילופי החומרים המזינים המקדמים אריכות ימים בתאים 13, ותסיסת מתח נמוכה לתרבית וצמיחה ממושכת14. שיפורים אלה שולבו בשיטה זו כדי לפתח אורגנואידים בוגרים המסוגלים לבטא פנוטיפים נוירודגנרטיביים ומזדקנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההיווצרות המתוקננת של EBs היא שלב קריטי בהמרה הניתנת לשחזור של תאי גזע פלוריפוטנטיים לאורגנואידים במוח. צבירת הכוח של תאי גזע לרקמות בודדות יכולה להשתנות בהתאם לגיאומטריה של הבארות הקעורות, צפיפות הזריעה והטיפול היטב. למרות שהשיטה הנוכחית מציינת טווח קוטר של 500-600 מיקרומטר לאחר 6 ימים, קטרים אלה אינם שוללים קטרים אחרים של היווצרות אורגנואידים נכונה, שכן קטרים רבים אחרים הוכחו כמוצלחים. עם זאת, קטרים משתנים הוכחו כמשפיעים על שיעורי בידול והצלחה29. למטרות שחזור, שינויי קוטר מתחת ל-50 מיקרומטר מומלצים מאוד20. בנוסף, ניתן להאריך את מספר ימי ההשראה העצבית מ-6 ל-10 ימים כדי לאפשר ל-EBs לגדול בקוטר, שכן השימוש במעכבי SMAD הוכח כמייצר ושומר ביעילות על היווצרות נוירואפיתליה לאחר 5 ימים בלבד של חשיפה30. בהיעדר מעכבי SMAD, אינדוקציה עצבית יכולה להניב תוצאות לא עקביות, הדורשות תקופות השראה ארוכות יותר. מעכבי SMAD שצוטטו בעבודה זו הם היעילים ביותר, אך ניתן להשתמש במולקולות קטנות אחרות של דורסומורפין ו- TGF-β בריכוז היעיל שלהן.
מטריצת קרום המרתף מספקת מצע מצוין לצמיחה וניתן לנהל אותה אחרת. שימושים מוקדמים במטריצה כללו את קרום הבסיס כציפוי באר31. עם זאת, השימוש במטריצה להטמעת רקמה הראה שיפור התמיינות והתבגרות ברקמות אלה32. עבור אורגנואידים, השימוש במטריצה הוכח כמשפר את התמיינות EB לאורגנואידים, מקדם התבגרות ומאריך תקופות תרבית33. בעוד אורגנואידים עדיין יכולים להיווצר ללא המטריצה, כפי שקבוצות רבות שאפו להשיג תרבית רקמה נטולת מטריצה 34,35, מחקרים מצאו כי לאורגנואידים המשובצים במטריצה יש סיכוי גבוה יותר לזמני תרבית ארוכים יותר ודורשים פחות תחזוקה36. שיטת הגומה של הטבעה מספקת כיסוי שווה של משטח האורגנואידים, ומבטיחה דיפוזיה דומה, גישה לחומרים מזינים והתמיינות הניתנת לשחזור. לחלופין, ניתן להשתמש בהטבעה של כיפה כדי לתמצת באופן מלא את האורגנואידים37.
העברת ה- EBs לגומות החן של מטריצת הממברנה היא שלב קריטי. למרות שלקצה פיפטה של 1 מ”ל יש פתח רחב מספיק כדי להעביר את ה- EBs, קצה של 200 מיקרוליטר עדיף כדי להקל על ההעברה. יש לחתוך את הקצוות של 200 μL כדי ליצור פתח גדול מספיק, מה שמבטיח קצה חלק כדי להפחית את לחץ הגזירה בעת פיפט. לחלופין, קיימים טיפים רחבים של 200 μL כדי להקל על ההעברה. פיפטינג צריך להיעשות לאט, שכן פיפטינג מהיר עלול לשבש את הפריפריה האורגנואידית ולעכב צמיחה תקינה. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת כדי להבטיח העברת מספיק מדיום כדי לספק חומרים מזינים. מעט מדי מדיום מסתכן בייבוש האורגנואיד וגורם לנמק. העברת EB עם יותר מדי מדיה תרבותית יכולה לגרום למטריצה להיות מדוללת מדי ולא לתמצת את האורגנואיד בצורה מאובטחת. באופן אידיאלי, אין לדלל את המטריצה ביותר מ -50% כדי להבטיח את פילמור שלה ולתפקד כ- ECM עבור EBs. אם ההטבעה נכשלת, ניתן לשחזר את ה- EB ולתמצת אותו מחדש. אנקפסולציה מחדש במטריצה הטרייה יכולה להיעשות בכל נקודה כדי לספק לאורגנואיד תמיכה נוספת.
בדומה להטמעת מטריצה לפיגומים, סיבי PLGA מספקים תמיכה נוספת לצמיחה תלת מימדית. שילוב סיבי PLGA, ששולבו במקור כדי לייצר אורגנואידים מוארכים ולהגדיל את שטח הפנים38, זוהה בהדרגה ככלי נוסף לשיפור התמיינות והבשלה של אורגנואידים39. ככל שמעבדות נוספות מנסות לצמצם את השימוש במטריצה או לבטל אותה לחלוטין, תכונות הארגון העצמי של אורגנואידים הנתמכות על ידי הסיבים המשולבים מספקות מספיק פיגומים ליצירת רקמות תלת ממדיות והתמיינות39. כאן, שתי השיטות שולבו כדי להגדיל את הסיכויים לתרבות ארוכת טווח38,39. שילוב הסיבים במהלך הצבירה הראשונית הוא קריטי, שכן אלה עשויים שלא להיות מוצגים בשלב מאוחר יותר. לאחר הצנטריפוגה, בדיקה כי כמה סיבים נמצאים בין התאים המצטברים תבטיח כי סיב משולב EB. אם לא יצליח, שאיפה עדינה של הבאר וצנטריפוגה מחדש אמורה להבטיח ערבוב.
צעד קריטי נוסף בתחזוקת אורגנואידים הוא הכנסת שייקר אורביטלי לזילוח מדיה טוב יותר. באיטרציות מוקדמות של פרוטוקולים אורגנואידים, ביוריאקטור מסתובב שימש ליצירת תסיסה11. שייקר אורביטלי ב-90 סל”ד מספק תסיסה מספקת מבלי להרוס את טיפת המטריצה או לפגוע במורפולוגיה של אורגנואידים. חלק מהקבוצות נמנעות משימוש בפיגום המטריקס אך שומרות על תסיסה כדי לספק סביבה מתאימה34. כמו בכל הפרוטוקולים, יש להתאים את מהירות הסיבובים בהתאם לשייקר כדי להפחית את כמות לחץ הגזירה. אם נבחרה הטמעת כיפה, ניתן להשתמש בשייקר מוטה כדי להפחית את כמות לחץ הגזירה11,34.
יחד, השילוב של מספר טכניקות נבחרות מספק שיטה חזקה ליצירת אורגנואידים הנגזרים מ- iPSC. ישנן מספר דרכים ליצור ולשמר אורגנואידים, אך רבות מהן מתמקדות במסלולי התמיינות מוקדמים. בעבודה זו, טכניקות רבות ושונות שולבו לתרבית אורגנואידים לפרקי זמן ממושכים, מעבר לשלב ההתמיינות, ולתקופת הבשלה שבה פנוטיפים מזדקנים יכולים להתחיל להתפתח. שילוב טכניקות אלה מאפשר התבגרות ממושכת ללא צורך בגורמים ביולוגיים אקסוגניים כדי לשמור על התרביות, תוך שמירה על הארגון העצמי וההתקדמות הטבעית של ההזדקנות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי יוזמת איבר-על-שבב ההולנדית, פרויקט כבידה של NWO (024.003.001) במימון משרד החינוך, התרבות והמדע של ממשלת הולנד. D.C.B. מודה תודה על התמיכה הכספית של Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) בצורה של מלגת דוקטורט.
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
| 6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
| B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
| BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
| ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
| Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
| Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
| Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
| Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
| HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
| MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
| PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
| QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
| SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
| Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
| XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |
References
- Liu, G. H., et al. Aging Atlas: a multi-omics database for aging biology. Nucleic Acids Research. 49, 825-830 (2021).
- Ferrucci, L., et al. Measuring biological aging in humans: A quest. Cell. 19 (2), 13080 (2020).
- Mertens, J., Reid, D., Lau, S., Kim, Y., Gage, F. H. Aging in a dish: iPSC-derived and directly induced neurons for studying brain aging and age-related neurodegenerative diseases. Annu Rev Genet. 52, 271-293 (2018).
- Mertens, J., et al. Age-dependent instability of mature neuronal fate in induced neurons from Alzheimer’s patients. Cell Stem Cell. 28 (9), 1533-1548 (2021).
- Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer’s disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1141-1154 (2018).
- Fang, E. F., et al. Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer’s disease. Nature Neuroscience. 22 (3), 401-412 (2019).
- Hu, J. L., Todhunter, M. E., LaBarge, M. A., Gartner, Z. J. Opportunities for organoids as new models of aging. Journal of Cell Biology. 217 (1), 39-50 (2018).
- Choi, S. H., et al. A three-dimensional human neural cell culture model of Alzheimer’s disease. Nature. 515 (7526), 274-278 (2014).
- Gonzalez, C., et al. Modeling amyloid beta and tau pathology in human cerebral organoids. Molecular Psychiatry. 23 (12), 2363-2374 (2018).
- Yoon, S. -. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Muratore, C. R., Srikanth, P., Callahan, D. G., Young-Pearse, T. L. Comparison and optimization of hiPSC forebrain cortical differentiation protocols. PLoS ONE. 9 (8), 105807 (2014).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2020).
- Goto-Silva, L., et al. Computational fluid dynamic analysis of physical forces playing a role in brain organoid cultures in two different multiplex platforms. BMC Developmental Biology. 19 (1), 1-10 (2019).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. Journal of Visualized Experiments. (68), e4327 (2012).
- Beers, J., et al. A cost-effective and efficient reprogramming platform for large-scale production of integration-free human induced pluripotent stem cells in chemically defined culture. Scientific Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
- Wakao, S., et al. Morphologic and gene expression criteria for identifying human induced pluripotent stem cells. PLoS ONE. 7 (12), e48677 (2012).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , (2022).
- Choy Buentello, D., Koch, L. S., Trujillo-De Santiago, G., Alvarez, M. M., Broersen, K. Use of standard U-bottom and V-bottom well plates to generate neuroepithelial embryoid bodies. PLOS ONE. 17 (5), 0262062 (2022).
- Ellis, P., et al. SOX2, a persistent marker for multipotential neural stem cells derived from embryonic stem cells, the embryo or the adult. Developmental Neuroscience. 26 (2-4), 148-165 (2004).
- Lee, S., et al. TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue. European Journal of Cell Biology. 84 (2-3), 453-459 (2005).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Soltani, M. H., et al. Microtubule-associated protein 2, a marker of neuronal differentiation, induces mitotic defects, inhibits growth of melanoma cells, and predicts metastatic potential of cutaneous melanoma. The American Journal of Pathology. 166 (6), 1841-1850 (2005).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2 (1), 67-77 (2006).
- Gusel’nikova, V. V., Korzhevskiy, D. E. NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker. Acta Naturae. 7 (25), 42-47 (2015).
- Rao, M. S., Hattiangady, B., Shetty, A. K. The window and mechanisms of major age-related decline in the production of new neurons within the dentate gyrus of the hippocampus. Aging Cell. 5 (6), 545-558 (2006).
- Meng, L., et al. A synapsin I cleavage fragment contributes to synaptic dysfunction in Alzheimer’s disease. Aging Cell. 21 (5), 13619 (2022).
- Moon, S. H., et al. Optimizing human embryonic stem cells differentiation efficiency by screening size-tunable homogenous embryoid bodies. Biomaterials. 35 (23), 5987-5997 (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Lee, S. -. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19 (3), 175-180 (2015).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Hocevar, S. E., Liu, L., Duncan, R. K. Matrigel is required for efficient differentiation of isolated, stem cell-derived otic vesicles into inner ear organoids. Stem Cell Research. 53, 102295 (2021).
- Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
- Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Communications Biology. 4 (1), 1-15 (2021).
- Kaiser, A., Kale, A., Novozhilova, E., Olivius, P. The effects of Matrigel® on the survival and differentiation of a human neural progenitor dissociated sphere culture. The Anatomical Record. 303 (3), 441-450 (2020).
- Kakni, P., et al. Intestinal organoid culture in polymer film-based microwell arrays. Advanced Biosystems. 4 (10), 2000126 (2020).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Tejchman, A., Znój, A., Chlebanowska, P., Frączek-Szczypta, A., Majka, M. Carbon fibers as a new type of scaffold for midbrain organoid development. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 5959 (2020).
