老化研究のためのiPS細胞由来脳オルガノイドの長期培養のための堅牢な組織作製

患者研究は治験審査委員会によって承認された。すべての参加者は、データと生物試料の再利用を許可するために、書面によるインフォームドコンセントとリポジトリの同意に署名しました。iPS細胞株は、IRBおよび治験ガイドラインに従って作製した。 図1 は、このプロトコルのワークフローの概略図を示しています。 1. iPS細胞の再プログラミングとメンテナンス 被験者の血液8mL(高齢者または疾患患者、65歳以上)をクエン酸ナトリウムを含む細胞調製チューブ(CPT)またはEDTAまたはヘパリン化チューブに収集します。 室温(RT)で1,800 x g で30分間遠心分離し、末梢血のみを含み血清を含まないペレットを回収します15。 製造元のプロトコル( 材料表を参照)に従って特殊なリプログラミングベクターを使用して、iPS細胞16を取得します。 フィーダーフリー、ラクトースデヒドロゲナーゼ上昇ウイルス(LDEV)フリーの還元成長因子基底膜マトリックスコーティングされた6ウェル培養プレートで、5%CO2を含む加湿雰囲気中、37°Cでエッセンシャル8(E8)培地(材料の表を参照)でiPS細胞を培養します。 過密や自発的な分化を避けるために、E8培地中のiPS細胞を3〜4日間維持します。 免疫蛍光マーカーを用いてiPS細胞株の多能性を検証し(ステップ2)、マイコプラズマを検査します(ステップ3)。 2. 多能性染色 溶液と抗体を保存するには、分析の3〜4日前に、コーティングされた(ステップ1.4)24ウェル培養プレート上に細胞を播種します。培地をピペットで吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)中の4%ホルムアルデヒドで細胞をRTで15〜20分間固定します。 細胞を1x PBSで3回洗浄し、PBS中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)中の0.1%Triton-X 100で少なくとも15分間、RTで1時間以内で透過処理します。 1x PBSで3回洗浄し、PBS中の5%BSAでRTで30分間ブロックします。 1x PBSで再度3回洗浄し、抗体Sox2およびOct3/4(1:100希釈; 材料の表を参照)、および核酸染色DAPIを1%BSA(1:4,000希釈)で4°Cで一晩加えます。光から保護するためにアルミホイルで包みます。 1x PBSで3回洗浄し、細胞をPBSのままにします。10〜20倍の倍率での蛍光顕微鏡による画像。多能性マーカーSox2およびOct3/4が細胞17、18の核に局在していることを確認します。 3. マイコプラズマ検査 注:詳細なアッセイの実行および分析手順については、検出キットのプロトコル( 材料表を参照)を参照してください。検出キットは、マイコプラズマ検査用の試薬、基質、およびアッセイバッファーを提供します。 細胞またはリフレッシュ培地を継代する前に、2〜3 mLの細胞培養培地を遠沈管に集め、細胞または破片を200 x g でRTで5分間ペレット化します。 上清を4°Cで≤5日間保存します。細胞を培地で少なくとも24時間インキュベートして、検出可能なシグナルを確保します。 100 μLの細胞上清を、新しいチューブまたは白壁の96ウェルプレートのウェルに追加します(不透明な底を推奨、 材料の表を参照)。試薬と基質をアッセイバッファーで再構成し、RTで15分間平衡化します。 100 μLの試薬をサンプルに加え、RTで5分間インキュベートします。 ルミノメーターで発光を測定します(測定#1)。 100 μLの基質をサンプルに加え、RTで10分間インキュベートします。 発光を測定します(測定#2)。 マイコプラズマ汚染は、測定値#2と#1の比率によって決定します。結果の解釈については、キットのマニュアルを参照してください。 4.マイクロフィラメントの準備 ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA、 材料表を参照)マイクロフィラメントの調製は、メスの鈍い端で縫合糸をほつれさせることによって開始します。擦り切れた繊維を70%エタノールで軽く塗る。 顕微鏡下で定規を使用して、PLGAファイバーを500μmから1mmの長さのストランドの断片に切断し始めます。合計で約25mmの繊維をカットします。フィラメントを1 mLの抗生物質抗真菌溶液を入れた15 mLチューブに保管します。フード内で、繊維溶液を10 mLのDMEM/F-12で希釈します(表1)。溶液を混合するためによく渦を巻く。注:無菌環境の細胞培養フローフードで作業してください。 20 μLのファイバー溶液を、96ウェルプレートの3つの胚様体(EB)形成ウェルに加えます。明視野顕微鏡下で、ウェルあたりの繊維を数えて平均します。ウェルあたり平均5〜10 PLGAマイクロフィラメントに希釈または濃縮します。この方法で各ウェルを準備します。 これで、ウェルに細胞を播種する準備が整いました。プレートは、必要になるまで室温で、翌日は4°Cで保管してください。 5. 胚様体(EB)形成 メモ: すべてのメディアとソリューションは、RT にウォームアップする必要があります。 iPS細胞が70%〜80%のコンフルエント性に達すると(図2A)、継代してEB形成に使用する準備が整います。10x-20倍の倍率で顕微鏡で細胞を確認します。コロニーが自発的分化の最小領域(<10%)を示すことを確認します。 培地をピペットで吸引し、DPBSで細胞を1回洗浄します。500 μLの細胞剥離溶液( 材料表を参照)または0.5 mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加えてコロニーを解離し、37°Cで3〜5分間インキュベートします。注:無菌環境の細胞培養フローフードで作業してください。 各ウェルに1 mLの新鮮なE8培地を加えて放出された細胞を収集し、すべての細胞が剥離するまで穏やかにピペットで留めます。 1.5 mLの細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、さらに1 mLの新鮮なE8培地を加えて、総容量2.5 mLにします。 290 x g でRTで3分間遠心分離します。 上清をピペットで吸引し、細胞ペレットを50μM ROCK阻害剤を添加した1mLのエッセンシャル6(E6、 材料表参照)培地に再懸濁し、血球計算盤19を用いて細胞を計数した。 50 μMのROCK阻害剤を添加したE6培地で、希望する播種密度に応じて60,000〜90,000細胞/mLの細胞懸濁液を調製します(材料の表を参照)。 150μLの細胞懸濁液を96ウェルULAプレート(または調製した凹型プレート20)の各ウェルに加える。ウェルあたり9,000〜11,000個の細胞を播種します。 プレートを遠心分離して、細胞を290 x g でRTで1分間強制凝集させます。 プレートを5%CO2を含む加湿雰囲気の37°Cのインキュベーターに入れます。 6.神経上皮誘導 24時間後、120 μLの培地をピペットで慎重に吸引します。ピペットチップをウェル内に下げすぎてEBを吸引しないように注意してください。 ウェルあたり2 μMのXAV939とSMAD阻害剤を添加した150 μLのE6培地(RT時)(10 μMのSB431542および500 nMのLDN 193189)を追加します(材料の表を参照)。 2 μMのXAV939、10 μMのSB431542、および500 nMのLDN 193189を添加した、新しく調製したE6培地で培地を毎日交換してください。注:6日目(DIV6)までに、EBの直径は550〜600μmになり、さらなる分化の準備が整うはずです。 7. オルガノイドの分化と成熟 メモ: すべてのメディアを RT にウォームアップする必要があります。 約DIV7で、すべてのEBが550〜600μmの直径に達し、滑らかで明確なエッジを表示するかどうかを確認します(図2B)。この段階で、それらは細胞外マトリックス(ECM)に埋め込まれる準備ができています。注意: 無菌環境で作業してください。 空のP200ボックスにフィルムシート(長さ約4枚)を置き、熱可塑性シーリングフィルム( 材料表を参照)からディンプル埋め込みシートを準備します。15 mLのコニカルチューブまたは500 μLのマイクロ遠心チューブを使用して、フィルムシートを穴にそっと押し下げて、12個のディンプルを作ります。フィルムシートに70%エタノールをスプレーし、UVライトを少なくとも30分間オンにしてフローフード内で乾燥させます。 十分な量の基底膜マトリックス(マトリゲル、 材料表を参照)を氷上で解凍し、フローフード内に置きます。注:EBあたり、約30μLの未希釈メンブレンマトリックスが必要です。メンブレンマトリックスは、ゲル化を防ぐために常に4°C未満に保ってください。プレチルドピペットチップは、ピペッティング中にマトリックスがチップ内で重合するのを減速させ、それによって材料の損失を低減するため、推奨されます。 ワイドボアP200チップを使用して、各ディンプルに1つのEBを移し、通常のピペットチップでできるだけ多くの培地を除去します。EBを乾燥させないように注意してください。通常のP200チップを使用して、各オルガノイドに~30 μLの未希釈メンブレンマトリックスを加え、EBが液滴の中心にあることを確認します。 すべてのEBがマトリックスに埋め込まれたら、EBを含むフィルムシートを滅菌ペトリ皿に入れます。注:オプションで、滅菌水で満たされた小さなペトリ皿をフィルムシートの横にある大きなペトリ皿に入れて、蒸発を防ぐことができます。ディッシュをインキュベーターに移し、5%CO2 を含む加湿雰囲気中で37°Cで約10分間インキュベートして、膜マトリックスを固化させます。 12個の包埋オルガノイドの各セットについて、ULA 6ウェルプレートの1ウェルにビタミンAを含まないB27を含む5 mLの分化培地(表1)を調製します。プレートをインキュベーター内で37°Cに予熱します。 インキュベーション時間が終了したら、フィルムシートを取り、シートの裏側からディンプルを押し出して、埋め込まれたEBをULA 6ウェルプレートに移します。必要に応じて、ウェルから1 mLを取り出し、シート上にピペットで留めて、液滴がフィルムから剥がれるようにします。注:重要な形態学的変化は、埋め込みの1日後に見られます。EBは、滑らかなエッジから芽を形成する膨らんだ突起になります(図2C)。 2日後(DIV9)、ハーフメディア交換を実行します。プロセス中に膜マトリックス液滴を吸引または損傷しないように注意してください。 さらに2日後(DIV11)、培地を完全に交換し、3 μMのCHIR99021を培地に補充します(材料の表を参照)。 DIV14で、培地をビタミンAを含むB27を含む分化培地に変更し(表1)、オルガノイドサイズを徐々に増やします。 DIV16で、ウェルプレートをインキュベーター内の90rpmのオービタルシェーカーに置きます。メディアは 2 日ごとに交換してください。 40 DIVごとに、培地50 mLごとに500 μLのメンブレンマトリックスを希釈して、培地中の栄養素を追加します。