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Neuroscience

Fabricação robusta de tecidos para cultura de longo prazo de organoides cerebrais derivados de iPSC para pesquisa de envelhecimento

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/64586
, ,
1Department of Applied Stem Cell Technologies, TechMed Centre Enschede,University of Twente, 2Centro de Biotecnología-FEMSA,Tecnologico de Monterrey, 3Department of Genetics,Harvard Medical School

Summary

O presente protocolo fornece um procedimento passo a passo para a geração, manutenção e envelhecimento reprodutíveis de organoides cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Este método permite cultivar e amadurecer organoides cerebrais por longos períodos, o que facilita a modelagem dos processos envolvidos no envelhecimento cerebral e na patogênese relacionada à idade.

Abstract

Os modelos animais e celulares atualmente disponíveis não recapitulam totalmente a complexidade das mudanças que ocorrem no cérebro humano envelhecido. Um desenvolvimento recente de procedimentos que descrevem a geração de organoides cerebrais humanos, derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs), tem o potencial de transformar fundamentalmente a capacidade de modelar e entender o envelhecimento do cérebro humano e processos patogênicos relacionados. Aqui, um protocolo otimizado para gerar, manter, envelhecer e caracterizar organoides cerebrais humanos derivados de iPSC é apresentado. Este protocolo pode ser implementado para gerar organoides cerebrais de forma reprodutível e serve como um guia passo-a-passo, incorporando as mais recentes técnicas que resultam em melhor maturação organoide e envelhecimento em cultura. Questões específicas relacionadas à maturação organoide, necrose, variabilidade e efeitos em lote estão sendo abordadas. Em conjunto, esses avanços tecnológicos permitirão a modelagem do envelhecimento cerebral em organoides derivados de uma variedade de doadores humanos jovens e idosos, bem como de indivíduos acometidos por distúrbios cerebrais relacionados à idade, permitindo a identificação de mecanismos fisiológicos e patogênicos do envelhecimento cerebral humano.

Introduction

Os modelos de doenças do envelhecimento têm se tornado cada vez mais relevantes à medida que a expectativa de vida humana continua a aumentar. Estudos genômicos em larga escala têm revelado populações idosas com desregulação de processos moleculares e alterações genéticas que afetam a qualidade de vida1. O processo de envelhecimento é caracterizado por uma perda geral da funcionalidade do organismo, incluindo perda da função cognitiva, aumento do risco de doenças neurodegenerativas e uma série de doenças crônicas2.

As técnicas atuais de cultura de células não representam adequadamente a natureza multifatorial do envelhecimento, uma vez que essas disfunções não podem ser adequadamente replicadas com o uso de mutações, toxinas ouinfecções3. Modelos animais que exploram o processo de envelhecimento são frequentemente associados a longos tempos experimentais e altos custos, mas também trazem consigo considerações éticas. O uso de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) de pacientes pode elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à progressão da doença, uma vez que as iPSCs permitem o desenvolvimento natural de células em tecido maduro3. As iPSCs tornaram-se o cavalo de batalha de muitos laboratórios que investigam doenças neurodegenerativas, uma vez que a reprogramação celular das células colhidas não parece apagar as marcas da doença ou do envelhecimento dos doadores4. Essas impressões recapitulam fenótipos celulares que têm sido demonstrados em modelos humanos e animais, tornando as iPSCs adequadas para examinar a deterioração celular individual do tecido cerebral altamente denso 5,6. Os organoides derivados do IPSC tornaram-se o modelo proeminente para a cultura tridimensional de tecidos, permitindo interações célula-célula mais complexas e uma melhor recapitulação do desenvolvimento. Embora usados principalmente para dados de desenvolvimento, os organoides têm sido cada vez mais aplicados na modelagem de doenças, especificamente modelos para inflamação, neurodegeneração e envelhecimento7. Com base em estudos anteriores de iPSC, os organoides retêm fenótipos de doença e fenótipos celulares dentro do contexto fisiológico de conexões de redes semelhantes a tecidos 8,9. No entanto, cultivar tecidos tridimensionais de certas dimensões pode ser um desafio, especialmente por longos períodos de tempo.

Este trabalho apresenta um método detalhado para a geração reprodutível de organoides cerebrais que permite que o tecido amadureça substancialmente em tamanho por períodos mais longos. A criação de organoides cerebrais tem permanecido relativamente padronizada, adotando-se métodos de vários protocolosproeminentes10,11. No entanto, várias modificações têm sido sugeridas para melhorar a diferenciação e manutenção. Esses métodos alternativos incluem o uso de fatores neurogênicos para aumentar a diferenciação neural12, scaffolds adicionais para melhorar a troca de nutrientes promovendo longevidade celular 13 e agitação de baixo estresse para cultura e crescimento prolongados14. Essas melhorias foram incorporadas a este método para desenvolver organoides maduros capazes de expressar fenótipos neurodegenerativos e de envelhecimento.

Protocol

Os estudos dos pacientes foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da instituição. Todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido e o consentimento do repositório para permitir que seus dados e bioespécimes fossem reaproveitados. As linhas iPSC foram geradas seguindo o CEP e as diretrizes institucionais. A Figura 1 ilustra uma visão geral esquemática do fluxo de trabalho desse protocolo. 1. Reprogramação e manutenção do iPSC Coletar 8 mL de sangue do indivíduo (paciente idoso ou doente; com 65 anos ou mais) em tubos de preparação celular (CPT) com citrato de sódio ou em tubos EDTA ou heparinizados. Centrifugar a 1.800 x g por 30 min à temperatura ambiente (TR) para coletar pastilha contendo apenas sangue periférico e sem soro15. Utilizar vetores de reprogramação especializados de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais) para obter iPSCs16. Culturas iPSCs em placas de cultura de 6 poços revestidas em meio Essential 8 (E8) em meio Essential 8 (E8) (ver Tabela de Materiais) a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO2. Manter iPSCs em meios E8 por 3-4 dias, a fim de evitar superlotação ou diferenciação espontânea. Validar a pluripotência das linhagens iPSC utilizando marcadores imunofluorescentes (passo 2) e testar para micoplasma (passo 3). 2. Coloração de pluripotência Para conservar soluções e anticorpos, semeie as células em placas de cultura de 24 poços revestidas (etapa 1.4) 3-4 dias antes da análise. Aspirar o meio com pipeta e fixar as células com formaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (1x PBS) por 15-20 minutos em TR. Lavar as células 3x com 1x PBS e permeabilizar com Triton-X 100 a 0,1% em albumina de soro bovino (BSA) a 1% em PBS por pelo menos 15 min, mas não mais do que 1 h em TR. Lavar 3x com 1x PBS e bloquear com 5% BSA em PBS por 30 min no TR. Lave novamente 3x com 1x PBS e adicione os anticorpos Sox2 e Oct3/4 (diluição de 1:100; ver Tabela de Materiais), e a coloração nucleica DAPI em BSA a 1% (diluição de 1:4.000) durante a noite a 4 °C . Embrulhe em papel alumínio para proteger da luz. Lave 3x com 1x PBS e deixe as células em PBS. Imagem com microscópio de fluorescência em aumento de 10-20x. Garantir que os marcadores de pluripotência Sox2 e Oct3/4 estejam localizados nos núcleos das células17,18. 3. Teste de micoplasma NOTA: Consulte o protocolo do kit de detecção (consulte a Tabela de Materiais) para obter etapas detalhadas de execução e análise do ensaio. O kit de detecção fornece o reagente, o substrato e o tampão de ensaio para o teste de micoplasma. Antes de passar células ou meio refrescante, colete 2-3 mL de meio de cultura celular em um tubo de centrífuga e pastilha quaisquer células ou detritos a 200 x g por 5 min em RT. Armazenar o sobrenadante a 4 °C por ≤5 dias. Incubar as células com o meio por pelo menos 24 h para garantir um sinal detectável. Adicionar 100 μL de sobrenadante celular a um tubo fresco ou poço de uma placa de 96 poços de paredes brancas (fundo opaco recomendado, ver Tabela de Materiais). Reconstituir o reagente e substrato no tampão de ensaio e equilibrar por 15 min em TR. Adicionar 100 μL do reagente à amostra e incubar por 5 min no TR. Meça a luminescência com um luminômetro (medida #1). Adicionar 100 μL do substrato à amostra e incubar por 10 min em RT. Meça a luminescência (medida #2). Determinar a contaminação por micoplasma pela razão de medição #2 para #1. Consulte o manual do kit para interpretação dos resultados. 4. Preparação de microfilamentos Comece a preparação dos microfilamentos de poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA, ver Tabela de Materiais) desfiando o fio de sutura com a extremidade romba de um bisturi. Esterilize levemente a fibra desfiada com etanol 70%. Sob o microscópio e usando uma régua, comece a cortar a fibra de PLGA em fragmentos de fios de 500 μm a 1 mm de comprimento. Corte cerca de 25 mm da fibra no total. Manter os filamentos em um tubo de 15 mL com 1 mL de solução antibiótico-antimicótica.No exaustor, diluir a solução de fibras com 10 mL de DMEM/F-12 (Tabela 1). Vórtice bem para misturar a solução.NOTA: Trabalhar em uma capela de fluxo de cultura celular em um ambiente estéril. Adicionar 20 μL da solução de fibra a três corpos embrionários (BE) formando poços de uma placa de 96 poços. Sob microscopia de campo claro, conte e faça a média das fibras por poço. Diluir ou concentrar até uma média de 5-10 microfilamentos de PLGA por poço. Prepare cada poço dessa maneira. Os poços agora estão prontos para serem semeados com células. Conservar o prato à temperatura ambiente até ser necessário ou a 4 °C no dia seguinte. 5. Formação do Corpo Embrionário (BE) NOTA: Todos os suportes e soluções devem ser aquecidos para RT. Uma vez que as iPSCs tenham atingido 70%-80% de confluência (Figura 2A), elas estão prontas para serem passadas e usadas para a formação do BE. Verifique as células com um microscópio em aumento de 10x-20x. Certifique-se de que as colônias apresentem áreas mínimas (<10%) de diferenciação espontânea. Aspirar o meio com uma pipeta e lavar as células uma vez com DPBS. Dissociar as colónias adicionando 500 μL de solução de descolamento celular (ver Tabela de Materiais) ou 0,5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incubar durante 3-5 minutos a 37 °C.NOTA: Trabalhar em uma capela de fluxo de cultura celular em um ambiente estéril. Recolher as células libertadas adicionando 1 ml de meio E8 fresco a cada poço e pipetar suavemente até que todas as células estejam separadas. Transfira 1,5 mL de suspensão celular para um tubo de 15 mL e adicione mais 1 mL de meio E8 fresco para atingir um volume total de 2,5 mL. Centrifugar a 290 x g por 3 min em RT. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta, ressuspender o pellet de células em 1 mL de meio Essential 6 (E6, ver Tabela de Materiais) suplementado com inibidor de ROCK de 50 μM e contar as células usando um hemocitômetro19. Preparar uma suspensão celular de 60.000-90.000 células/mL, dependendo da densidade de semeadura desejada, em meio E6 suplementado com 50 μM de inibidor de ROCK (ver Tabela de Materiais). Adicionar 150 μL da suspensão celular em cada poço de uma placa ULA de 96 poços (ou uma placa côncava preparada20). Semear 9.000-11.000 células por poço. Centrifugar a placa para forçar a agregação das células a 290 x g por 1 min no TR. Coloque a placa na incubadora a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO2. 6. Indução neuroepitelial Após 24 h, aspirar cuidadosamente 120 μL do meio com uma pipeta. Certifique-se de não aspirar o EB baixando a ponta da pipeta muito para dentro do poço. Adicionar 150 μL de meio E6 (em RT) suplementado com 2 μM de XAV939 e os inibidores SMAD: 10 μM de SB431542 e 500 nM de LDN 193189 por poço (ver Tabela de Materiais). Troque o meio diariamente com meios E6 recém-preparados suplementados com 2 μM de XAV939, 10 μM de SB431542 e 500 nM de LDN 193189.NOTA: Até o dia 6 (DIV6), os EBs devem ter um diâmetro de 550-600 μm e estar prontos para maior diferenciação. 7. Diferenciação e maturação organoide NOTA: Todas as mídias precisam ser aquecidas para RT. Em aproximadamente DIV7, verificar se todos os EBs atingiram um diâmetro de 550-600 μm e apresentam uma borda lisa e clara (Figura 2B); nesta fase, estão prontos para serem incorporados em uma matriz extracelular (MEC).NOTA: Trabalhar em um ambiente estéril. Prepare folhas de embutir onduladas a partir do filme de vedação termoplástico (consulte Tabela de Materiais) colocando uma folha de filme (cerca de 4 pol.) em uma caixa P200 vazia. Usando um tubo cônico de 15 mL ou um tubo de microcentrífuga de 500 μL, pressione suavemente a folha de filme nos orifícios para fazer 12 covinhas. Borrife a folha de filme com etanol 70% e deixe secar dentro da capela de fluxo com a luz UV acesa por pelo menos 30 min. Descongelar uma quantidade suficiente de matriz de membrana basal (Matrigel, ver Tabela de Materiais) no gelo e colocá-la dentro da capela de fluxo.NOTA: Por EB, são necessários aproximadamente 30 μL de matriz de membrana não diluída. Mantenha sempre a matriz de membrana abaixo de 4 °C para evitar que gelifique. Ponteiras de pipeta pré-resfriadas também são recomendadas, pois desaceleram a matriz da polimerização na ponta durante a pipetagem, reduzindo assim a perda de material. Usando uma ponta P200 de furo largo, transfira um EB para cada escurecimento e remova o máximo de mídia possível com uma ponta de pipeta normal. Fique atento para não deixar os EBs secarem. Usando uma ponta P200 regular, adicione ~30 μL de matriz de membrana não diluída a cada organoide, garantindo que o EB esteja no centro da gota. Uma vez que todos os EBs estejam embutidos na matriz, coloque a folha de filme contendo os EBs em uma placa de Petri estéril.NOTA: Opcionalmente, uma pequena placa de Petri cheia de água estéril pode ser colocada na placa de Petri maior ao lado da folha de filme para evitar a evaporação.Transfira a placa para uma incubadora e incube a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 por aproximadamente 10 min para deixar a matriz de membrana se solidificar. Para cada conjunto de 12 organoides incorporados, preparar 5 mL de meio de diferenciação com B27 sem vitamina A (Tabela 1) em um poço de uma placa ULA de 6 poços. Pré-aqueça a placa a 37 °C em uma incubadora. Uma vez terminado o tempo de incubação, transfira os EBs embutidos para a placa ULA de 6 poços pegando a folha de filme e empurrando as covinhas da parte de trás da folha. Se necessário, retire 1 mL do poço e pipete-o para a folha para ajudar as gotículas a se desprenderem do filme.NOTA: Alterações morfológicas importantes podem ser observadas 1 dia após a incorporação; As EBs deixam de ter bordas lisas para protuberâncias protuberantes formando gemas (Figura 2C). Após 2 dias (DIV9), realizar uma troca de meio meio. Tenha cuidado para não aspirar ou danificar as gotículas da matriz de membrana no processo. Após mais 2 dias (DIV11), realizar uma troca completa de mídia, complementando a mídia com 3 μM de CHIR99021 (ver Tabela de Materiais). Na DIV14, trocar o meio para meio de diferenciação com B27 com vitamina A (Tabela 1) para um aumento gradual do tamanho do organoide. No DIV16, coloque a placa de poço em um agitador orbital a 90 rpm dentro de uma incubadora. Troque a mídia a cada 2 dias. A cada 40 DIV, diluir 500 μL da matriz de membrana para cada 50 mL de meio para obter nutrientes adicionais no meio.

Representative Results

A integração de fibras de PLGA, incorporação de covas e agitação leva a uma geração robusta de organoides cerebrais que permite que culturas derivadas de iPSC sejam mantidas por longos períodos de tempo (Figura 1). Figura 1: Ilustração esquemática do fluxo de trabalho e da linha do tempo desse método. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. O período inicial de indução neural é comparável aos procedimentos previamentepublicados11. Os corpos embrionários (BE) iniciam-se como agregados circulares (Figura 2B) com bordas brancas ou transparentes. À medida que a EB é alterada de meio de indução neural para meio de manutenção neural na DIV7, surgem saliências e brotamentos dentro de 24 h do tecido circular (Figura 2C). Além disso, à medida que o organoide continua a crescer, a área de superfície da fibra de PLGA ajuda o organoide a alongar-se (Figura 2D). Durante a maturação, as bordas do organoide precisam permanecer intactas, pois é um bom sinal de células saudáveis e desenvolvimento; caso contrário, nutrientes adicionais devem ser fornecidos13 (Figura 2E). O crescimento dos organoides é ainda facilitado pela agitação da cultura organoide, pois melhora a perfusão com nutrientes. Figura 2: Diferenciação e maturação dos organoides cerebrais . (A) Imagem representativa de uma cultura iPSC com 70%-80% de confluência. (B) Corpos embrionários (BEs) foram gerados e a formação de neuroepiteliais foi induzida até a DIV7. As EBs foram então incluídas na matriz de membrana e posteriormente diferenciadas em organoides cerebrais. (C) Organoides em DIV10 exibindo formações de brotamento distintas. Os organoides podem ser amadurecidos na matriz de membrana usando (D) covinha ou (E) incorporação sanduíche, aqui mostrada em DIV30. (F) A cultura de longa duração mostra organoides cerebrais crescendo até tamanhos significativos (DIV70). Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. As dimensões e morfologia externa do organoide são complementadas por uma arquitetura complexa dentro do organoide. Após a fixação do tecido na DIV7 após o primeiro estágio de diferenciação, as células da EB expressam SOX2, um fator de transcrição HMG box que atua como marcador para células-tronco neuraismultipotentes21, bem como a proteína pareada caixa Pax-6, indicando células progenitoras neurais (Figura 3). Neurônios imaturos marcados por TuJ1 (classe III β-tubulina)22 já podem ser vistos espalhados por todo o tecido. Nesta fase, torna-se evidente um exemplo da auto-organização pela qual estes organoides passam. A organização das estruturas radiais, chamadas rosetas, é análoga ao tubo neural, com células SOX2+ no centro da roseta21 e PAX6 em direção à periferia da roseta. Essas rosetas dão origem a neurônios à medida que migram para fora. Essas células irradiantes são inicialmente duplamente positivas para o marcador de células-tronco neurais/progenitoras Nestin23 e proteína glial fibrilar ácida (GFAP), semelhante à glia radial encontrada em áreas neurogênicas do cérebro in vivo . À medida que esses neurônios migratórios amadurecem, os marcadores citoesqueléticos refletem essa alteração22. O marcador de diferenciação neural em estágio inicial TuJ1 22 é visível no círculo interno da roseta e se desloca para a proteína 2 associada aos microtúbulos (MAP2 )24, um marcador de maturação neurônio-específico na periferia. Figura 3: Os corpos embrionários na DIV7 mostram organização estrutural e caracterização imatura. Imagem imunohistoquímica de montagem inteira de uma EB na DIV7. (A) Imagem composta do EB exibindo (B) rosetas neurais SOX2+, (C) neurônios imaturos (TUJ1) espalhados pelo EB, (D) células progenitoras neurais (PAX6) e (E) núcleos visualizados pelo DAPI. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. À medida que os organoides envelhecem, a organização e os marcadores dos neurônios em desenvolvimento começam a replicar condições fisiológicas. Na DIV30, muitas rosetas que dão origem a regiões neurogênicas equivalentes ao cérebro em desenvolvimento podem ser observadas25. Na DIV60, essas regiões neurogênicas SOX2+ são inexistentes e são substituídas por MAP2 maduras e NeuN26, um marcador de diferenciação de neurônios, e neurônios positivos (Figura 4 e Figura 5). Figura 4: Os organoides na DIV120 mostram caracterização neuronal madura. Imagem imunoistoquímica de um corte organoide no DIV 120. (A) Imagem composta da seção mostrando marcadores neuronais maduros de (B) MAP2 (roxo) e (C) NeuN (verde). (D) Os núcleos foram visualizados pelo DAPI. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: PCR digital de gotículas de organoides DIV120. Gráficos digitais de PCR em gotículas mostrando o valor absoluto de expressão de (A) MAP2 (superior, azul) e (B) NeuN (inferior, verde). Linhas amarelas cortadas separam diferentes linhas iPSC (A, B, C, etc.), e organoides foram agrupados. N = 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Esses marcadores citoesqueléticos podem ser usados em conjunto com outros marcadores pós-mitóticos (como doublecortin27 e synapsin28) para sondar a plasticidade sináptica e outros declínios relacionados à idade (Figura 6), bem como tecido cerebral adicional como astrócitos e glia (Figura 7). Figura 6: Exemplo de análise terminal sináptica. Imagem imunoistoquímica de um corte do organoide no DIV 120. (A) Imagem composta da seção corada para (B) MAP2, (C) doublecortin (DCX) e (D) synapsin I (SYN). (E) Os núcleos foram visualizados pelo DAPI. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Evidência de desenvolvimento glial. Imagem imunoistoquímica de um corte do organoide no DIV 120. (A) Imagem composta da seção corada para (B) molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizada 1 (Iba1) e (C) NeuN. (D) Os núcleos foram visualizados pelo DAPI. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Reagente Concentração Final Volume (50 mL total) DMEM-F12 50% 25 mL Meio Neurobasal 50% 25 mL Suplemento N2 (100x) 1x 0,25 mL Suplemento B27 -/+ Vitamina A (50x) 0,5x 0,5 mL Insulina 0.25% 12,5 μL GlutaMAX (100x) 1x 0,5 mL MEM-NEAA (100x) 0,5x 0,25 mL HEPES (1 M) 10 mM 0,5 mL Antibiótico/Antimicótico (100x) 1x 0,5 mL 2-β-mercaptoetanol 50 μM 17,5 μL *NOTA: alguns DMEM-F12 já contém GlutaMAX, não há necessidade de adicionar adicionais. Tabela 1: Composição dos meios de diferenciação utilizados no presente estudo.

Discussion

A formação padronizada de EBs é uma etapa crítica na conversão reprodutível de células-tronco pluripotentes em organoides cerebrais. A agregação de força de células-tronco em tecidos singulares pode variar dependendo da geometria dos poços côncavos, densidade de semeadura e tratamento do poço. Embora o método atual cite uma faixa de diâmetro de 500-600 μm após 6 dias, esses diâmetros não excluem outros diâmetros de formação organoide adequada, como muitos outros diâmetros têm se mostrado bem-sucedidos. No entanto, diâmetros variados têm demonstrado influenciar as taxas de diferenciação e osucesso29. Para fins de reprodutibilidade, variações de diâmetro abaixo de 50 μm são altamenterecomendadas20. Além disso, o número de dias de indução neural pode ser estendido de 6 a 10 dias para permitir que as EBs cresçam em diâmetro, uma vez que o uso de inibidores da SMAD demonstrou produzir e manter eficientemente a formação de neuroepitélios após apenas 5 dias de exposição30. Na ausência de inibidores da SMAD, a indução neural pode produzir resultados inconsistentes, exigindo períodos de indução mais longos. Os inibidores de SMAD citados neste trabalho são os mais eficazes, mas outras moléculas pequenas de dorsomorfina e TGF-β podem ser usadas em sua concentração efetiva.

A matriz da membrana basal fornece um excelente substrato para o crescimento e pode ser administrada de forma diferente. Os primeiros usos da matriz incluíram a membrana basal como revestimentode poços 31. Entretanto, o uso da matriz para inclusão tecidual mostrou melhorar a diferenciação e maturação desses tecidos32. Para organoides, o uso da matriz demonstrou melhorar a diferenciação da EB em organoides, promover a maturação e prolongar os períodos de cultura33. Embora os organoides ainda possam ser formados sem a matriz, já que muitos grupos têm se esforçado para realizar uma cultura de tecidos livre de matriz34,35, estudos descobriram que os organoides embutidos na matriz têm maior chance de tempos de cultura prolongados e requerem menos manutenção 36. O método de incorporação de covas proporciona cobertura igual da superfície organoide, garantindo difusão semelhante, acesso a nutrientes e diferenciação reprodutível. Alternativamente, a incorporação de cúpula pode ser empregada para encapsular totalmente os organoides37.

A transferência das EBs para as covinhas da matriz de membrana é uma etapa crítica. Embora uma ponta de pipeta de 1 mL tenha uma abertura larga o suficiente para transferir as EBs, uma ponta de 200 μL é preferida para facilitar a transferência. As pontas de 200 μL precisam ser cortadas para criar uma abertura grande o suficiente, garantindo uma borda lisa para reduzir a tensão de cisalhamento durante a pipetagem. Alternativamente, existem pontas de 200 μL de furo largo para facilitar a transferência. A pipetagem precisa ser feita lentamente, pois a pipetagem rápida pode interromper a periferia organoide e dificultar o crescimento adequado. Atenção especial deve ser tomada para garantir que o meio suficiente seja transferido para fornecer nutrientes. Muito pouco meio corre o risco de ressecar o organoide, causando necrose. A transferência do EB com muito meio de cultura pode fazer com que a matriz fique muito diluída e não consiga encapsular o organoide com segurança. O ideal é que a matriz não seja diluída em mais de 50% para garantir sua polimerização e funcionar como MEC para os EBs. Se a incorporação não for bem-sucedida, o EB poderá ser recuperado e reencapsulado. O reencapsulamento na matriz fresca pode ser feito a qualquer momento para fornecer suporte adicional ao organoide.

Semelhante à incorporação de matriz para andaimes, as fibras PLGA fornecem suporte adicional para o crescimento tridimensional. Originalmente incorporada para produzir organoides alongados e aumentar a área superficial38, a incorporação de fibras de PLGA tem sido progressivamente identificada como uma ferramenta adicional para melhorar a diferenciação e maturação dos organoides39. À medida que mais laboratórios procuram reduzir o uso da matriz ou aboli-la completamente, as propriedades auto-organizáveis dos organoides suportados pelas fibras incorporadas fornecem arcabouços suficientes para a criação e diferenciação de tecidos tridimensionais39. Aqui, ambos os métodos foram combinados para aumentar as chances de cultura a longo prazo38,39. A incorporação de fibras durante a agregação inicial é fundamental, pois estas podem não ser introduzidas posteriormente. Após a centrifugação, verificar se algumas fibras estão entre as células agregadas garantirá que uma fibra seja incorporada ao BE. Se não for bem-sucedida, uma aspiração suave do poço e a recentrifugação devem garantir a mistura.

Outro passo crítico na manutenção dos organoides é a introdução de um agitador orbital para melhor perfusão dos meios. Nas primeiras iterações dos protocolos organoides, um biorreator giratório foi usado para criar agitação11. Um agitador orbital a 90 rpm fornece agitação suficiente sem destruir a gotícula da matriz ou danificar a morfologia organoide. Alguns grupos evitam o uso do arcabouço matricial, mas mantêm a agitação do agitador para proporcionar um ambiente adequado34. Como em todos os protocolos, a velocidade das rotações deve ser ajustada dependendo do agitador para reduzir a quantidade de tensão de cisalhamento. Se uma incorporação de cúpula fosse escolhida, um agitador inclinado poderia ser empregado para reduzir a quantidade de tensão de cisalhamento11,34.

Em conjunto, a integração de várias técnicas selecionadas fornece um método robusto de formação de organoides derivados de iPSC. Existem várias maneiras de criar e manter organoides, mas muitas delas se concentram em trajetórias de diferenciação precoce. Neste trabalho, múltiplas técnicas diferentes foram combinadas para cultivar organoides por longos períodos de tempo, após a fase de diferenciação e em um período de maturação onde os fenótipos de envelhecimento podem começar a se desenvolver. A incorporação dessas técnicas permite uma maturação prolongada sem a necessidade de fatores biológicos exógenos para a manutenção das culturas, mantendo a auto-organização e a progressão natural do envelhecimento.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Netherlands Organ-on-Chip Initiative, um projeto NWO Gravitation (024.003.001) financiado pelo Ministério da Educação, Cultura e Ciência do governo dos Países Baixos. D.C.B. agradece o apoio financeiro do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) na forma de uma bolsa de doutorado.

Materials

2-β-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 31350010
4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) Invitrogen D1306 1:4000
6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate  Greiner Bio-One 657185
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Fisher Scientific 136101
Accutase Sigma-Aldrich 46964 cell detachment solution 
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240062
B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) Gibco 17504044
B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) Gibco 12587010
BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes Thermo Fisher Scientific 02-685-125
Bovine Serum Albumin  Sigma-Aldrich A9418
Centrifuge Eppendorf 5810 R With plate holders
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune Sendai Reprogramming Vector Thermo Fisher Scientific A1378001
ddPCR primers | human | MAPT Bio-Rad dHsaCPE192234
ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN)  Bio-Rad dHsaCPE5052108
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11320074
Doublecortin (DCX) Santa Cruz Biotechnology SC-8066 1:500
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190144 no calcium, no magnesium
Eppendorf cups, 1.5 mL  Eppendorf 0030 125.215
Essential 6 Gibco A1516401
Essential 8 Gibco A1517001
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)  Invitrogen 15575020
Falcon tubes, 15 mL, conical Greiner Bio-One 188271-N
Formaldehyde  Sigma-Aldrich 252549 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
GlutaMax (100x) Gibco 35050038
Hemacytometer cell counter Hausser scientific 1490
HEPES Buffer Thermo Fisher Scientific 15-630-080
Insulin Sigma-Aldrich I9278
LDN 193189 StemCell Technologies 72147
MAP2 Abcam ab32454 1:200
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free Corning 356230 basement membrane matrix
MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) Thermo Fisher Scientific 11140050
Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader Perkin Elmer  1420 luminometer
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza LT07-318
N-2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502-048
NeuN Millipore MAB377 1:500
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049
Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 Santa Cruz Biotechnology sc-5279 AF647 1:100
Parafilm Bemis PM-996 thermoplastic film sheet
PAX6 Thermo Fisher Scientific 42-6600 1:200
Penicillin/Streptomycin Gibco 15070063
Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments Ethicon J463
QX200 Droplet digital PCR system Bio-Rad 1864001
ROCK inhibitor (Y27632) Selleck Chemicals S1049
SB431542  R&D Systems 1614/50
SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience Invitrogen 53-9811-80 1:100
Synapsin I (SYN) Calbiochem 574777 1:200
Triton-X 100  Sigma-Aldrich T8787
TUJ1 Santa Cruz Biotechnology sc-80005 Beta-3-tubulin; 1:500
XAV939 Tocris Bioscience 3748
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References

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Koch, L. S., Choy Buentello, D., Broersen, K. Robust Tissue Fabrication for Long-Term Culture of iPSC-Derived Brain Organoids for Aging Research. J. Vis. Exp. (195), e64586, doi:10.3791/64586 (2023).
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