Détection de la protéine prion anormale par immunohistochimie

Selon l’hypothèse du prion, l’isoforme anormale (PrP^Sc) est le composant principal, ou unique, de l’agent infectieux dans les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST). La confirmation du diagnostic des EST repose sur l’immunodétection de la PrP^Sc par application de protocoles d’immunohistochimie (IHC) et/ou de méthodes d’immunotransfert occidental (WB) des tissus de l’encéphale¹.

L’IHC est une méthode utilisant des anticorps monoclonaux ou, dans certains cas, polyclonaux (comme anticorps primaires) comme première étape dans l’immunomarquage d’antigènes d’intérêt spécifiquement ciblés situés dans les cellules d’une section de tissu. Toute liaison anticorps-antigène primaire efficace est ensuite visualisée à l’aide d’anticorps secondaires spécifiques aux anticorps primaires. Ces anticorps secondaires sont conjugués à des enzymes, telles que la peroxydase de raifort (HRP) ou la phosphatase alcaline (AP). La visualisation est ensuite réalisée en ajoutant un substrat à ces enzymes, produisant des produits de couleur insolubles localisés dans les zones où les anticorps primaires sont liés aux antigènes ciblés. Une meilleure visualisation peut être obtenue par contre-coloration, dans laquelle un colorant est utilisé pour créer un contraste entre les tissus immunomarqués et non immunomarqués².

Avec l’IHC utilisant des tissus incorporés à la paraffine fixés au formol (FFPE), la fixation du formol peut annuler l’efficacité des anticorps primaires en raison de la réticulation par le formaldéhyde et du chauffage et de la déshydratation pendant l’incorporation de la paraffine. Ceux-ci modifient la conformation des protéines, détruisant, dénaturant ou masquant les épitopes, diminuant ou abrogeant ainsi leur détection³. En tant que tel, cela nécessite la récupération d’antigènes (AR). Les techniques AR perturbent la réticulation du groupe chimique lié au formaldéhyde dans les molécules antigéniques, restaurant ou démasquant ainsi la conformation antigène-protéine d’origine. Il en résulte la récupération de l’affinité anticorps-antigène (épitope) pour l’immunomarquage. L’efficacité éventuelle de l’EI dépend des qualités de l’antigène ciblé et/ou de l’anticorps primaire².

La récupération de l’antigène (épitope) induite par la chaleur (HIER) est une procédure du RA³ et est couramment utilisée pour la détection de la^{PrP Sc} IHC, comme décrit ici. L’IHC est essentielle pour le diagnostic et utilisée dans les laboratoires de recherche pour déterminer la distribution tissulaire d’un antigène associé à une pathologie. Il est largement utilisé dans le diagnostic et la recherche sur le cancer, les neurosciences et les maladies infectieuses⁴, entre autres. Pour les EST, l’IHC joue un rôle important dans le diagnostic et la recherche pour confirmer et étudier la distribution de^{PrP Sc} dans les hôtes naturels et les modèles expérimentaux. IHC contribue aux études de pathogenèse des prions et à l’analyse des types et des profils de dépôt de^{PrP Sc} , notamment dans les tissus neuraux⁵, afin de détecter les écarts par rapport aux infections décrites systématiquement et d’identifier les nouvelles souches présumées de prions.

Étant donné que les prions de l’encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) peuvent infecter les humains, certains protocoles de laboratoire impliqués dans le travail avec l’ESB peuvent nécessiter l’utilisation d’installations et de pratiques BSL-3⁶. Il s’agit notamment de l’utilisation d’un contenant secondaire scellé pour transporter des échantillons de tissus potentiellement infectés par l’ESB à l’intérieur de l’institut et du laboratoire. Il comprend également la désignation de zones de confinement et d’équipement dédié aux prions pour la recherche et l’analyse de l’ESB, dans la mesure du possible. Ceci est fait pour prévenir la contamination à l’extérieur de la zone de travail et fournir un espace confiné puisque des procédures de décontamination deviennent nécessaires.

Par conséquent, le Laboratoire de pathologie de l’INIAV suit les installations et les pratiques recommandées de niveau de biosécurité 3 (BSL-3)⁶ pour gérer les échantillons potentiels de tissus infectés par des prions provenant de bovins, de petits ruminants et de cervidés associés à la surveillance des EST.

Les tissus fixés au formol et incorporés dans la paraffine inclus dans les procédures de diagnostic ou de recherche sur les EST, en particulier dans le système nerveux central, peuvent être potentiellement infectieux. Par conséquent, ces tissus fixes doivent être traités avec de l’acide formique pour réduire l’infectiosité des prions, s’ils sont présents, avant le traitement des tissus. Ceci est effectué en plaçant des tissus fixes et coupés (environ 2-4 mm d’épaisseur) dans une cassette de traitement. La cassette est ensuite immergée dans de l’acide formique à 98% (pendant 1 h). Après immersion, les cassettes avec des mouchoirs sont lavées à l’eau courante du robinet pendant 30 minutes et retournées au fixateur avant un traitement ultérieur. Si les coupes de tissus ne sont pas traitées avant le traitement, les coupes de tissus post-microtomiques doivent être immergées dans de l’acide formique non dilué pendant au moins 5 minutes avant coloration histologique⁷. Le protocole IHC pour PrP^Sc comprend une étape de démasquage systématique des épitopes de l’acide formique, servant également à inactiver les prions⁷. Après ces étapes d’inactivation des prions, les tissus fixes résultants peuvent ensuite être traités à BSL-2 en utilisant les pratiques standard BSL-2.

L’exigence minimale d’échantillonnage tissulaire pour le diagnostic des EST chez tout animal inclus dans la surveillance des EST est la collecte du tronc cérébral (au niveau obex). En outre, pour détecter l’ESB atypique et la tremblante, il est conseillé de prélever également une partie du cervelet ^1,8. Pour le diagnostic de la MDC, les ganglions lymphatiques du tronc cérébral (obex) et du rétropharynx doivent être testés, car la PrP Sc pourrait être détectée dans les tissus lymphoïdes sans PrP^Sc détectable dans l’obex⁹, examinée par Machado et ^coll.10.

La partie obex du tronc cérébral comprend les sites cibles diagnostiques des EST, à savoir le noyau vagal dorsal (DVN), le noyau solitaire (STN) et le noyau du tractus rachidien du nerf trijumeau (V). Ces zones présentent systématiquement une accumulation bilatérale de PrP^Sc , même aux premiers stades de l’ESB et de la tremblante classique. Dans les cas cliniques d’EST avancée, toutes les zones de matière grise du tronc cérébral présentent une distribution étendue de PrP^{Sc 11}.

Avant la section et le traitement, les échantillons de cerveau sont évalués (Figure 1) pour déterminer le niveau d’autolyse et la présence de toute lésion tissulaire susceptible de compromettre l’adéquation de l’échantillon pour un diagnostic de confirmation basé sur l’IHC⁸. Pour valider l’intégrité des protocoles de préparation et des résultats d’analyse, les échantillons de tissus positifs et négatifs aux EST sont inclus comme témoins en conjonction avec la préparation de tissus à partir de cas d’essai dans chaque essai.

Figure 1 : La procédure^{PrP Sc} IHC. Représentation montrant la séquence étape par étape de la procédure^{PrP Sc} IHC depuis la déparaffinisation des coupes tissulaires jusqu’à l’immunomarquage et la détection éventuels (FFPE – Paraffine fixée au formol – Embedded de paraffine; Mab – anticorps monoclonal; DAB – 3,3′ diaminobenzidine). Cette figure a été créée en BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.