İmmünohistokimya ile Anormal Prion Proteininin Saptanması
Summary
İmmünohistokimya protokollerini kullanarak anormal prion proteininin immüno-etiketlemesi, spesifik numune ve anti-PrP antikor hazırlama metodolojileri gerektirir. Bu protokol, uygun PrP immün etiketlemesini sağlamak ve spesifik olmayan arka plan boyamasını en aza indirmek için epitop demasking işlemindeki temel adımları açıklamaktadır. Ayrıca, bu yaklaşım, prion ile enfekte olmuş dokularla immünohistokimya çalışmaları yaparken biyogüvenlik önlemlerini de göz önünde bulundurur.
Abstract
Anormal prion proteinleri (PrPSc), hücresel prion proteininin hastalıkla ilişkili izoformu ve bulaşıcı süngerimsi ensefalopatilerin (TSE’ler) tanısal belirteçleridir. Bu nörodejeneratif hastalıklar insanları ve çeşitli hayvan türlerini etkiler ve scrapie, zoonotik sığır süngerimsi ensefalopati (BSE), servidlerin kronik israf hastalığı (CWD) ve yeni tanımlanan deve prion hastalığını (CPD) içerir. TSE’lerin tanısı, ensefalon dokularına, yani beyin sapına (obex seviyesi) hem immünohistokimya (IHC) hem de batı immünoblot yöntemlerinin (WB) uygulanması ile PrPSc’nin immün tespitine dayanır. IHC, bir doku kesitinin hücrelerinde tutulan antijenlere karşı primer antikorları (monoklonal veya poliklonal) kullanan yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Antikor-antijen bağlanması, antikorun hedeflendiği doku veya hücre bölgesinde lokalize kalan bir renk reaksiyonu ile görselleştirilebilir. Bu nedenle prion hastalıklarında, diğer araştırma alanlarında olduğu gibi, immünohistokimya teknikleri sadece tanı amaçlı değil, patogenez çalışmalarında da kullanılmaktadır. Bu tür çalışmalar, yeni prion suşlarını tanımlamak için daha önce tarif edilenlerden PrPSc modellerini ve tiplerini tespit etmeyi içerir. BSE insanları enfekte edebileceğinden, TSE gözetimine dahil edilen sığır, küçükbaş hayvan ve servid örneklerini işlemek için biyogüvenlik laboratuvarı seviye-3 (BSL-3) tesislerinin ve/veya uygulamalarının kullanılması önerilmektedir. Ek olarak, kontaminasyonu sınırlamak için mümkün olduğunda muhafaza ve priona özel ekipman önerilir. PrPSc IHC prosedürü, bu teknikte kullanılan formalin sabit ve parafin gömülü dokular bulaşıcı kaldığı için prion inaktivasyon önlemi olarak da işlev gören bir formik asit epitop demasking adımından oluşur. Sonuçları yorumlarken, spesifik olmayan immüno-etiketlemeyi hedef etiketlemeden ayırt etmek için özen gösterilmelidir. Bu amaçla, bilinen TSE-negatif kontrol hayvanlarında elde edilen immünoetiketleme artefaktlarını, TSE suşları, konakçı türler ve prnp genotipi arasında değişebilen spesifik PrPSc immünoetiketleme tiplerinden ayırt etmek için tanımak önemlidir.
Introduction
Prion hipotezine göre, anormal izoform (PrPSc), bulaşıcı süngerimsi ensefalopatilerde (TSE’ler) enfeksiyöz ajanın birincil veya tek bileşenidir. TSE tanısının doğrulanması, ensefalon dokularının immünohistokimya (IHC) protokolleri ve/veya batı immünoblot yöntemlerinin (WB) uygulanması ile PrPSc’nin immün tespitine dayanır1.
IHC, bir doku kesitinin hücrelerinde bulunan spesifik olarak hedeflenmiş antijenlerin immünoboyanmasında ilk adım olarak monoklonal veya bazı durumlarda poliklonal antikorların (primer antikorlar olarak) kullanıldığı bir yöntemdir. Herhangi bir etkili primer antikor-antijen bağlanması daha sonra primer antikorlara özgü sekonder antikorlar kullanılarak görselleştirilir. Bu ikincil antikorlar, yaban turpu peroksidaz (HRP) veya alkalen fosfataz (AP) gibi enzimlere konjuge edilir. Görselleştirme daha sonra bu enzimlere bir substrat eklenerek elde edilir ve birincil antikorların hedeflenen antijenlere bağlandığı alanlarda lokalize çözünmeyen renk ürünleri üretilir. Geliştirilmiş görselleştirme, immüno-işaretli ve immüno-etiketsiz doku2 arasında bir kontrast oluşturmak için bir boyanın kullanıldığı karşı boyama ile elde edilebilir.
Formalin ile sabitlenmiş parafin gömülü dokular (FFPE) kullanan IHC ile, formalin fiksasyonu, formaldehit ile çapraz bağlanma ve parafin gömme sırasında ısıtma ve dehidrasyon nedeniyle primer antikorların etkinliğini geçersiz kılabilir. Bunlar proteinlerin konformasyonunu değiştirir, epitopları yok eder, denatüre eder veya maskeler, böylece tespitlerini azaltır veya iptal eder3. Bu nedenle, bu antijen geri kazanımı (AR) gerektirir. AR teknikleri, antijenik moleküllerde formaldehit ile ilişkili kimyasal grup çapraz bağlanmasını bozar, böylece orijinal antijen-protein konformasyonunu geri yükler veya maskesini çıkarır. Bu, immünoetiketleme için antikor-antijen (epitop) afinitesinin geri kazanılmasıyla sonuçlanır. AR’nin nihai etkinliği, hedeflenen antijenin ve / veya birincil antikor2’nin niteliklerine bağlıdır.
Isıya bağlı antijen (epitop) geri kazanımı (HIER), AR3’ün bir prosedürüdür ve burada açıklandığı gibi PrPSc IHC tespiti için rutin olarak kullanılır. IHC tanı için gereklidir ve patoloji ile ilişkili bir antijenin doku dağılımını belirlemek için araştırma laboratuvarlarında kullanılır. Diğerlerinin yanı sıra kanser, sinirbilim vebulaşıcı hastalıkların 4 teşhis ve araştırmalarında yaygın olarak kullanılır. TSE’ler için IHC, doğal konakçılarda ve deneysel modellerde PrPSc dağılımının doğrulanması ve araştırılması için tanı ve araştırmada önemli bir rol oynamaktadır. IHC, prion patogenezi çalışmalarına ve rutin olarak tanımlanan enfeksiyonlardan sapmaları tespit etmek ve varsayılan yeni prion suşlarını tanımlamak için prion patogenezi çalışmalarına ve PrPSc birikim tiplerinin ve paternlerinin analizine, yani sinir dokularında5’e katkıda bulunur.
Sığır süngerimsi ensefalopati prionları (BSE) insanları enfekte edebildiğinden, BSE ile yapılan çalışmalarda yer alan bazı laboratuvar protokolleri BSL-3 tesislerinin ve uygulamalarının kullanılmasını gerektirebilir6. Bunlar, potansiyel BSE ile enfekte olmuş doku örneklerini enstitü ve laboratuvar içinde taşımak için kapalı bir ikincil kap kullanmayı içerir. Ayrıca, mümkün olduğunda BSE araştırma ve analizi için muhafaza alanlarının ve priona özel ekipmanların belirlenmesini de içerir. Bu, çalışma alanı dışındaki kontaminasyonu önlemek ve dekontaminasyon prosedürleri gerekli hale geldiğinden sınırlı bir alan sağlamak için yapılır.
Buna göre, INIAV Patoloji Laboratuvarı, TSE sürveyansı ile ilişkili sığır, küçükbaş hayvan ve servidlerden potansiyel prion ile enfekte olmuş doku örnekleriniyönetmek için önerilen biyogüvenlik seviyesi-3 (BSL-3) tesislerini ve uygulamalarını 6 takip etmektedir.
TSE tanı veya araştırma prosedürlerinde yer alan formalin ile sabitlenmiş ve parafin gömülü dokular, özellikle merkezi sinir sisteminde, potansiyel olarak bulaşıcı olabilir. Bu nedenle, bu sabit dokular, eğer varsa, doku işlemeden önce prionların bulaşıcılığını azaltmak için formik asit ile muamele edilmelidir. Bu, sabit, kesilmiş dokuların (yaklaşık 2-4 mm kalınlığında) bir işleme kasetine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Kaset daha sonra% 98 formik aside batırılır (1 saat boyunca). Daldırma işleminden sonra, mendilli kasetler 30 dakika boyunca akan musluk suyunda yıkanır ve daha fazla işlemden önce fiksatife geri döndürülür. Doku kesitleri işlenmeden önce tedavi edilmezse, post-mikrotomik doku kesitleri histolojik boyamadan önce en az 5 dakika seyreltilmemiş formik aside batırılmalıdır7. PrPSc için IHC protokolü, prionları inaktive etmeye de hizmet eden rutin bir formik asit epitop demasking adımı içerir7. Bu prion inaktivasyon adımlarından sonra, elde edilen sabit dokular daha sonra standart BSL-2 uygulamaları kullanılarak BSL-2’de işlenebilir.
TSE gözetimine dahil edilen herhangi bir hayvanda TSE tanısı için minimum doku örnekleme gereksinimi beyin sapının toplanmasıdır (obex seviyesinde). Ek olarak, atipik BSE ve scrapie’yi tespit etmek için, beyinciğin bir kısmının da toplanması önerilir 1,8. CWD tanısı için, hem beyin sapı (obex) hem de retrofaringeal lenf nodları test edilmelidir, çünkü PrP Sc, obex9’da saptanabilir PrPSc olmayan lenfoid dokularda tespit edilebilir, Machado ve ark.10 tarafından gözden geçirilmiştir.
Beyin sapının obeks kısmı, tanısal TSE hedef bölgelerini, yani dorsal vagal çekirdeği (DVN), soliter sistem çekirdeğini (STN) ve trigeminal sinirin spinal sistem çekirdeğini (V) içerir. Bu alanlar, BSE ve klasik scrapie’nin erken evrelerinde bile sürekli olarak bilateral PrPSc birikimi gösterir. İleri TSE’nin klinik vakalarında, beyin sapındaki tüm gri cevher alanları yaygın PrPSc dağılımı gösterir11.
Bölümleme ve işlemeden önce, beyin örnekleri, otoliz seviyesini ve numunenin IHC tabanlı doğrulayıcı tanı için uygunluğunu potansiyel olarak tehlikeye atan herhangi bir doku hasarının varlığını belirlemek için değerlendirilir (Şekil 1)8. Hazırlayıcı protokollerin ve analitik sonuçların bütünlüğünü doğrulamak için, TSE pozitif ve negatif doku örnekleri, her tahlilde test durumlarından dokuların hazırlanması ile birlikte kontrol olarak dahil edilir.
Resim 1: PrPSc IHC prosedürü. PrPSc IHC prosedürünün doku kesitlerinin deparafinizasyonundan nihai immünoboyama ve tespitine kadar adım adım sırasını gösteren gösterim (FFPE – Formalin-sabit parafin-gömülü; Mab – monoklonal antikor; DAB – 3,3′ diaminobenzidin). Bu rakam BioRender.com yılında oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
TSE’ler potansiyel zoonotik hastalıklardır. 1986 yılında Birleşik Krallık’ta BSE’nin ortaya çıkmasından sonra Portekiz, bu hastalığın görülme sıklığı14,15 olan Avrupa Birliği Üye Devletlerinden biri haline gelmiştir. Bu hastalığın kontrol altına alınması için ortaya çıkan diğer TSE’ler (klasik ve atipik scrapie, BSE varyantları ve günümüzde servidlerde kronik israf hastalığının sürveyansı), Gıda ve Veterinerlik Genel Müd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu makale, FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) – FEDER -Balcão2020 tarafından desteklenen POCI-01-0145-FEDER-029947 “Portekiz’de kronik israf hastalığı risk değerlendirmesi” Projesi tarafından finanse edilmiştir. Ayrıca, CECAV araştırma biriminin yazarları, UIDB / CVT / 0772/2020 projesi kapsamında FCT’den fon aldı.Batı Bölgesel Araştırma Merkezi, USDA, Araştırma Direktörü (emekli) Bruce C. Campbell’e yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | Undituled |
| Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water | |||
| Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase |
Vector Laboratories | PK-6100 | Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing. |
| Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L) | Vector Laboratories | BA-2000-1.5 | Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections. |
| Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase | Vector Laboratories | SK-4100 | Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section. |
| DakoCytomation Pascal pressure chamber | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich’s Hematoxylin: | |||
| Hematoxylin | Merck | 115938 | Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use. |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 101830 | |
| Potassium alum | Merck | 1.01047.1000 | |
| Glycerin | Merck | 1.04091.1000 | |
| Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2): | 40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use |
||
| Hydrogen peroxide (30% w/w) | Scharlau | HI0136 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
| Formic acid 98% | Merck | 1.00264.1000 | Undiluted |
| Microtome | Shandon-AS325 | Microtome | Shandon-AS325 |
| Mounting medium Entellan | Merck | 107960 | Ready- to- use. |
| Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum |
Gibco |
16050-122 |
Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section). |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time. |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10 | Cayman Chemical Company | 189710 | PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11 |
| Shandon CoverplateTM chamber | Thermo Scientific | 72110017 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining center | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack | Thermo Scientific | 73310017 | |
| Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1): | 2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day. |
||
| Tri-sodium citrate dihydrate | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759 | |
| Staining jar and basket | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Superfrost Plus microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6): | 10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day. |
||
| TRIZMA BASE | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Xylene | Panreac Applied Chem ITW reagents | 251769 | Undiluted |
References
- . WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. – Scrapie (Version May 2022) Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2022)
- Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M., Oliver, C., Jamur, M. Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 588, 103-119 (2010).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry). Journal Pharmacy Bioallied Sciences. 4, 307-309 (2012).
- Orge, L., et al. Neuropathology of Animal Prion Diseases. Biomolecules. 11 (3), 466 (2021).
- . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020 Available from: https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf (2022)
- APHA. Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo & IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet – International Reference Laboratory for TSE. , (2022).
- Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019)
- TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019)
- Machado, C. N., et al. TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control. Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).
- APHA. Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo & IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet – International Reference Laboratory for TSE. , (2019).
- Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep. The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).
- Simmons, M. M., et al. Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls. Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).
- Orge, L., et al. Identification of H-type BSE in Portugal. Prion. 9 (1), 22-28 (2015).
- Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle. Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).
- Pires, M. A., Travassos, F. S., Gärtner, F. Atlas of veterinary pathology. Biopathology. Lidel VII. 195 (6), 179-180 (2004).
- Pires, M. A., et al. Immunology protocols, didactic series. Applied Sciences. , 357 (2010).
