Detección de proteína priónica anormal por inmunohistoquímica

Según la hipótesis del prión, la isoforma anormal (PrP^Sc) es el componente primario, o único, del agente infeccioso en las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). La confirmación para el diagnóstico de EET se basa en la inmunodetección de PrP^Sc mediante la aplicación de protocolos de inmunohistoquímica (IHC) y/o métodos de inmunoblot occidentales (WB) de tejidos de encéfalo¹.

IHQ es un método que emplea anticuerpos monoclonales o, en algunos casos, policlonales (como anticuerpos primarios) como primer paso en la inmunotinción de antígenos de interés específicamente dirigidos localizados en células de una sección de tejido. Cualquier unión primaria efectiva anticuerpo-antígeno se visualiza utilizando anticuerpos secundarios específicos para los anticuerpos primarios. Estos anticuerpos secundarios se conjugan con enzimas, como la peroxidasa de rábano picante (HRP) o la fosfatasa alcalina (AP). La visualización se logra agregando un sustrato a estas enzimas, produciendo productos de color insolubles localizados en áreas donde los anticuerpos primarios están unidos a los antígenos objetivo. Se puede lograr una mejor visualización mediante la contratinción, en la que se utiliza un tinte para crear un contraste entre el tejido inmunomarcado y el no inmunomarcado².

Con IHQ utilizando tejidos embebidos en parafina fijados en formalina (FFPE), la fijación de formalina puede anular la efectividad de los anticuerpos primarios debido a la reticulación por formaldehído y el calentamiento y la deshidratación durante la incrustación de parafina. Estos cambian la conformación de las proteínas, destruyendo, desnaturalizando o enmascarando los epítopos, disminuyendo o abrogando así su detección³. Como tal, esto requiere recuperación de antígenos (AR). Las técnicas de AR interrumpen la reticulación del grupo químico relacionado con el formaldehído en las moléculas antigénicas, restaurando o desenmascarando así la conformación antígeno-proteína original. Esto da como resultado la recuperación de la afinidad anticuerpo-antígeno (epítopo) para el inmunomarcaje. La eficacia eventual de la RA depende de las cualidades del antígeno diana y/o del anticuerpo primario².

La recuperación de antígenos (epítopos) inducidos por calor (HIER) es un procedimiento de AR³ y se usa de forma rutinaria para la detección de IHC de PrP^Sc , como se describe en este documento. La IHQ es esencial para el diagnóstico y se utiliza en laboratorios de investigación para determinar la distribución tisular de un antígeno asociado a la patología. Es ampliamente utilizado en el diagnóstico e investigación del cáncer, la neurociencia y las enfermedades infecciosas⁴, entre otros. Para las EET, la IHQ desempeña un papel importante en el diagnóstico y la investigación para confirmar e investigar la distribución de PrP^Sc en huéspedes naturales y modelos experimentales. IHQ contribuye a los estudios de patogénesis de priones y al análisis de los tipos y patrones de depósito de PrP^Sc , es decir, en tejidos neurales⁵, para detectar desviaciones de infecciones descritas rutinariamente e identificar nuevas cepas de priones putativas.

Debido a que los priones de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) pueden infectar a los seres humanos, ciertos protocolos de laboratorio involucrados en el trabajo con la EEB pueden requerir el uso de instalaciones y prácticas BSL-3⁶. Estos incluyen el uso de un recipiente secundario sellado para transportar posibles muestras de tejido infectadas con EEB dentro del instituto y el laboratorio. También incluye la designación de áreas de contención y equipos dedicados a priones para la investigación y el análisis de la EEB siempre que sea posible. Esto se hace para evitar la contaminación fuera del área de trabajo y proporcionar un espacio confinado ya que los procedimientos de descontaminación se hacen necesarios.

En consecuencia, el Laboratorio de Patología del INIAV sigue las instalaciones y prácticas recomendadas de bioseguridad nivel 3 (BSL-3)⁶ para manejar posibles muestras de tejidos infectados por priones de bovinos, pequeños rumiantes y cérvidos asociados con la vigilancia de EET.

Los tejidos fijados en formalina e incrustados en parafina incluidos en los procedimientos de diagnóstico o investigación de EET, especialmente en el sistema nervioso central, pueden ser potencialmente infecciosos. Por lo tanto, estos tejidos fijos deben tratarse con ácido fórmico para reducir la infectividad de los priones, si están presentes, antes del procesamiento del tejido. Esto se realiza colocando tejidos fijos y recortados (aproximadamente 2-4 mm de espesor) en un casete de procesamiento. El casete se sumerge en ácido fórmico al 98% (durante 1 h). Después de la inmersión, los casetes con pañuelos de papel se lavan en agua corriente del grifo durante 30 minutos y se devuelven al fijador antes de su posterior procesamiento. Si las secciones de tejido no se tratan antes del procesamiento, las secciones de tejido postmicrotómico deben sumergirse en ácido fórmico sin diluir durante al menos 5 minutos antes de la tinción histológica⁷. El protocolo IHC para PrP^Sc incluye un paso rutinario de desenmascaramiento de epítopos de ácido fórmico, que también sirve para inactivar los priones⁷. Después de estos pasos de inactivación de priones, los tejidos fijos resultantes se pueden procesar en BSL-2 utilizando prácticas estándar de BSL-2.

El requisito mínimo de muestreo de tejido para el diagnóstico de EET en cualquier animal incluido en la vigilancia de EET es la recolección del tronco encefálico (a nivel de la ex). Además, para detectar la EEB y la tembladera atípicas, se aconseja que también se recoja parte del cerebelo ^1,8. Para el diagnóstico de CWD, tanto los ganglios linfáticos del tronco encefálico (obex) como los retrofaríngeos deben ser probados, ya que PrP Sc podría detectarse en tejidos linfoides sin PrP^Sc detectable en el obex⁹, revisado por Machado et ^al.10.

La porción obex del tronco encefálico incluye sitios diana de diagnóstico de EET, a saber, el núcleo vagal dorsal (DVN), el núcleo del tracto solitario (STN) y el núcleo del tracto espinal del nervio trigémino (V). Estas zonas presentan sistemáticamente acumulación bilateral de^{PrP Sc} , incluso en las primeras fases de la EEB y la tembladera clásica. En los casos clínicos de EET avanzada, todas las áreas de materia gris dentro del tronco encefálico muestran una distribución generalizada de PrP^{Sc 11}.

Antes de la sección y el procesamiento, las muestras de cerebro se evalúan (Figura 1) para determinar el nivel de autólisis y la presencia de cualquier daño tisular que pueda comprometer la idoneidad de la muestra para el diagnóstico confirmatorio basado en IHQ⁸. Para validar la integridad de los protocolos preparatorios y los resultados analíticos, las muestras de tejido positivas y negativas para EET se incluyen como controles junto con la preparación de tejidos a partir de casos de prueba en cada ensayo.

Figura 1: El procedimiento IHC de PrP^Sc . Representación que muestra la secuencia paso a paso del procedimiento IHC de PrP^Sc desde la desparafinización de secciones de tejido hasta la eventual inmunotinción y detección (FFPE – Formalin-fixed paraffin-embedded; Mab – anticuerpo monoclonal; DAB – 3,3′ diaminobencidina). Esta figura fue creada en BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.