Rilevazione di proteine prioniche anomale mediante immunoistochimica

Secondo l’ipotesi prionica, l’isoforma anomala (PrP^Sc) è l’unico componente primario dell’agente infettivo nelle encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE). La conferma per la diagnosi di TSE si basa sull’immunorilevazione della PrP^Sc mediante l’applicazione di protocolli immunoistochimici (IHC) e/o metodi immunoblot occidentali (WB) dei tessuti dell’encefalo¹.

L’IHC è un metodo che impiega anticorpi monoclonali o, in alcuni casi, policlonali (come anticorpi primari) come primo passo nell’immunocolorazione di antigeni di interesse specificamente mirati situati nelle cellule di una sezione tissutale. Qualsiasi legame efficace anticorpo-antigene primario viene quindi visualizzato utilizzando anticorpi secondari specifici per gli anticorpi primari. Questi anticorpi secondari sono coniugati agli enzimi, come la perossidasi di rafano (HRP) o la fosfatasi alcalina (AP). La visualizzazione si ottiene quindi aggiungendo un substrato a questi enzimi, producendo prodotti di colore insolubili localizzati in aree in cui gli anticorpi primari sono legati agli antigeni bersaglio. Una migliore visualizzazione può essere ottenuta contrastando, in cui un colorante viene utilizzato per creare un contrasto tra tessuto immunomarcato e non immunomarcato².

Con IHC che utilizza tessuti incorporati in paraffina fissati in formalina (FFPE), la fissazione della formalina può annullare l’efficacia degli anticorpi primari a causa della reticolazione mediante formaldeide e riscaldamento e disidratazione durante l’incorporazione di paraffina. Questi modificano la conformazione delle proteine, distruggendo, denaturando o mascherando gli epitopi, diminuendo o abrogando così la loro rilevazione³. Come tale, ciò richiede il recupero dell’antigene (AR). Le tecniche AR interrompono il cross-linking dei gruppi chimici correlati alla formaldeide nelle molecole antigeniche, ripristinando o smascherando così la conformazione originale antigene-proteina. Ciò si traduce nel recupero dell’affinità anticorpo-antigene (epitopo) per l’immunomarcatura. L’eventuale efficacia dell’AR dipende dalle qualità dell’antigene bersaglio e/o dell’anticorpo primario².

Il recupero dell’antigene indotto dal calore (epitopo) (HIER) è una procedura di AR³ e viene utilizzato di routine per il rilevamento di PrP^Sc IHC, come descritto nel presente documento. L’IHC è essenziale per la diagnosi e viene utilizzato nei laboratori di ricerca per determinare la distribuzione tissutale di un antigene associato alla patologia. È ampiamente usato nella diagnosi e nella ricerca di cancro, neuroscienze e malattie infettive⁴, tra gli altri. Per le TSE, l’IHC svolge un ruolo importante nella diagnosi e nella ricerca per confermare e studiare la distribuzione di PrP^Sc negli ospiti naturali e nei modelli sperimentali. IHC contribuisce agli studi sulla patogenesi prionica e all’analisi dei tipi e dei modelli di deposizione di PrP^Sc , vale a dire, nei tessuti neurali⁵, per rilevare deviazioni dalle infezioni descritte di routine e identificare nuovi ceppi prionici putativi.

Poiché i prioni dell’encefalopatia spongiforme bovina (BSE) possono infettare l’uomo, alcuni protocolli di laboratorio coinvolti nel lavoro con la BSE possono richiedere l’uso di strutture e pratiche BSL-3⁶. Questi includono l’uso di un contenitore secondario sigillato per trasportare potenziali campioni di tessuto infetto da BSE all’interno dell’istituto e del laboratorio. Comprende anche la designazione di aree di contenimento e attrezzature dedicate ai prioni per la ricerca e l’analisi della BSE ogniqualvolta possibile. Questo viene fatto per prevenire la contaminazione al di fuori dell’area di lavoro e fornire uno spazio ristretto poiché le procedure di decontaminazione diventano necessarie.

Di conseguenza, il Laboratorio di Patologia dell’INIAV segue le strutture e le pratiche raccomandate di livello 3 di biosicurezza (BSL-3)⁶ per gestire potenziali campioni di tessuti infetti da prioni di bovini, piccoli ruminanti e cervidi associati alla sorveglianza delle TSE.

I tessuti fissati in formalina e incorporati in paraffina inclusi nelle procedure diagnostiche o di ricerca sulle TSE, specialmente nel sistema nervoso centrale, possono essere potenzialmente infettivi. Quindi, questi tessuti fissi devono essere trattati con acido formico per ridurre l’infettività dei prioni, se presenti, prima della lavorazione dei tessuti. Questo viene eseguito posizionando tessuti fissi e rifilati (circa 2-4 mm di spessore) in una cassetta di lavorazione. La cassetta viene quindi immersa in acido formico al 98% (per 1 ora). Dopo l’immersione, le cassette con i fazzoletti vengono lavate in acqua corrente del rubinetto per 30 minuti e restituite al fissativo prima di ulteriori elaborazioni. Se le sezioni di tessuto non vengono trattate prima della lavorazione, le sezioni di tessuto post-microtomico devono essere immerse in acido formico non diluito per almeno 5 minuti prima della colorazione istologica⁷. Il protocollo IHC per PrP^Sc include una fase di routine di epitopo dell’acido formico, che serve anche a inattivare i prioni⁷. Dopo queste fasi di inattivazione dei prioni, i tessuti fissi risultanti possono quindi essere elaborati a BSL-2 utilizzando pratiche standard BSL-2.

Il requisito minimo di campionamento dei tessuti per la diagnosi di TSE in qualsiasi animale incluso nella sorveglianza delle TSE è la raccolta del tronco encefalico (a livello dell’obex). Inoltre, per rilevare BSE e scrapie atipiche, si consiglia di raccogliere anche una parte del cervelletto ^1,8. Per la diagnosi di CWD, sia il tronco encefalico (obex) che i linfonodi retrofaringei dovrebbero essere testati poiché PrP Sc potrebbe essere rilevato nei tessuti linfoidi senza PrP^Sc rilevabile nell’obex⁹, esaminato da Machado et ^al.10.

La porzione obex del tronco encefalico comprende siti bersaglio diagnostici TSE, vale a dire il nucleo vagale dorsale (DVN), il nucleo del tratto solitario (STN) e il nucleo del tratto spinale del nervo trigemino (V). Queste aree presentano costantemente un accumulo bilaterale di PrP^Sc , anche nelle prime fasi della BSE e della scrapie classica. Nei casi clinici di TSE avanzata, tutte le aree della materia grigia all’interno del tronco encefalico mostrano una diffusa distribuzione di PrP^{Sc 11}.

Prima del sezionamento e dell’elaborazione, i campioni cerebrali vengono valutati (Figura 1) per accertare il livello di autolisi e la presenza di eventuali danni tissutali che potrebbero compromettere l’idoneità del campione per la diagnosi di conferma basata su IHC⁸. Per convalidare l’integrità dei protocolli preparativi e dei risultati analitici, i campioni di tessuto positivo e negativo alla TSE sono inclusi come controlli in combinazione con la preparazione dei tessuti dai casi di prova in ciascun test.

Figura 1: La procedura PrP^Sc IHC. Rappresentazione che mostra la sequenza passo-passo della procedura PrP^Sc IHC dalla deparaffinizzazione di sezioni tissutali all’eventuale immunocolorazione e rilevazione (FFPE – Formalin-fixed paraffin-embedded; Mab – anticorpo monoclonale; DAB – 3,3′ diaminobenzidina). Questa figura è stata creata nel BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.