Detecção de Proteína Priônica Anormal por Imunohistoquímica

De acordo com a hipótese do príon, a isoforma anormal (^{PrP Sc}) é o componente primário, ou único, do agente infeccioso nas encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET). A confirmação para o diagnóstico de EET baseia-se na imunodetecção de^{PrP Sc} por meio da aplicação de protocolos de imunohistoquímica (IHQ) e/ou métodos de immunoblot ocidental (WB) de tecidos encéfalos¹.

A imunoistoquímica é um método que emprega anticorpos monoclonais ou, em alguns casos, policlonais (como anticorpos primários) como primeiro passo na imunomarcação de antígenos especificamente direcionados de interesse localizados em células de um corte tecidual. Qualquer ligação anticorpo-antígeno primário eficaz é então visualizada usando anticorpos secundários específicos para os anticorpos primários. Esses anticorpos secundários são conjugados a enzimas, como a peroxidase de raiz forte (HRP) ou a fosfatase alcalina (FA). A visualização é então obtida pela adição de um substrato a essas enzimas, produzindo produtos de cor insolúveis localizados em áreas onde os anticorpos primários estão ligados aos antígenos alvo. Uma melhor visualização pode ser obtida pela contracoloração, em que um corante é usado para criar um contraste entre tecido imunomarcado e não imunomarcado².

Com a IHQ usando tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE), a fixação de formalina pode anular a eficácia dos anticorpos primários devido à reticulação por formaldeído e ao aquecimento e desidratação durante a inclusão da parafina. Estas alteram a conformação das proteínas, destruindo, desnaturando ou mascarando os epítopos, diminuindo ou anulando sua detecção³. Como tal, isso requer recuperação de antígeno (AR). As técnicas de RA interrompem a ligação cruzada de grupos químicos relacionados ao formaldeído nas moléculas antigênicas, restaurando ou desmascarando a conformação antígeno-proteína original. Isso resulta na recuperação da afinidade anticorpo-antígeno (epítopo) para a imunomarcação. A eventual eficácia da RA depende das qualidades do antígeno alvo e/ou do anticorpo primário².

A recuperação do antígeno induzido pelo calor (epítopo) (HIER) é um procedimento do AR³ e é usado rotineiramente para detecção de IHQ^{PrP Sc} , conforme descrito aqui. A imunoistoquímica é essencial para o diagnóstico e utilizada em laboratórios de pesquisa para determinar a distribuição tecidual de um antígeno associado à patologia. É amplamente utilizada no diagnóstico e pesquisa de câncer, neurociências, doenças infecciosas⁴, entre outras. Para EET, a IHQ desempenha um papel importante no diagnóstico e na pesquisa para confirmar e investigar a distribuição de^{PrP Sc} em hospedeiros naturais e modelos experimentais. A IHQ contribui para estudos de patogênese priônica e análise de tipos e padrões de deposição de^{PrP Sc} , ou seja, em tecidos^neurais5, para detectar desvios de infecções rotineiramente descritas e identificar possíveis novas cepas de príons.

Uma vez que os priões da encefalopatia espongiforme bovina (EEB) podem infectar seres humanos, certos protocolos laboratoriais envolvidos no trabalho com a EEB podem exigir a utilização de instalações e práticas de BSL-3⁶. Estes incluem a utilização de um recipiente secundário selado para transportar potenciais amostras de tecidos infectados com EEB dentro do instituto e do laboratório. Inclui também a designação de áreas de contenção e de equipamento dedicado ao prião para a investigação e análise da BSE, sempre que possível. Isso é feito para evitar a contaminação fora da área de trabalho e proporcionar um espaço confinado, uma vez que os procedimentos de descontaminação se tornam necessários.

Assim, o Laboratório de Patologia do INIAV segue as instalações^{e práticas de} nível de biossegurança 3 (BSL-3) recomendadas 6 para gerenciar amostras potenciais de tecidos infectados por príons de bovinos, pequenos ruminantes e cervídeos associados à vigilância de EET.

Tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina incluídos em procedimentos de diagnóstico ou pesquisa de EET, especialmente no sistema nervoso central, podem ser potencialmente infecciosos. Assim, esses tecidos fixados devem ser tratados com ácido fórmico para reduzir a infectividade dos príons, se presentes, antes do processamento do tecido. Isso é realizado através da colocação de tecidos fixos e aparados (aproximadamente 2-4 mm de espessura) em um de processamento. O é então imerso em ácido fórmico a 98% (por 1 h). Após a imersão, os com tecidos são lavados em água corrente da torneira por 30 min e retornam ao fixador antes do processamento posterior. Se os cortes de tecido não forem tratados antes do processamento, os cortes de tecido pós-microtômicos devem ser imersos em ácido fórmico não diluído por pelo menos 5 minutos antes da coloração histológica⁷. O protocolo IHQ para PrP^Sc inclui uma etapa rotineira de desmascaramento de epítopos de ácido fórmico, servindo também para inativar príons⁷. Após essas etapas de inativação do príon, os tecidos fixados resultantes podem então ser processados em BSL-2 usando práticas BSL-2 padrão.

O requisito mínimo de amostragem de tecidos para o diagnóstico de EET em qualquer animal incluído na vigilância de EET é a recolha do tronco encefálico (ao nível do obex). Além disso, para a detecção de EEB e tremor epizoótico atípicos, recomenda-se que parte do cerebelo também seja coletada ^1,8. Para o diagnóstico de DC, tanto os linfonodos do tronco encefálico (obex) quanto os retrofaríngeos devem ser testados, pois a PrP Sc pode ser detectada em tecidos linfoides sem^{PrP Sc} detectável no ^obex9, revisada por Machado et ^al.10.

A porção obex do tronco encefálico inclui os locais-alvo diagnósticos da EET, a saber, o núcleo vagal dorsal (DVN), o núcleo do trato solitário (NST) e o núcleo do trato espinhal do nervo trigêmeo (V). Estas zonas apresentam consistentemente acumulação bilateral de^{PrP Sc} , mesmo nas fases iniciais da EEB e do tremor epizoótico clássico. Nos casos clínicos de EET avançada, todas as áreas de substância cinzenta no tronco encefálico apresentam ampla distribuição de^{PrP Sc11}.

Antes da secção e processamento, as amostras de encéfalo são avaliadas (Figura 1) para verificar o grau de autólise e a presença de qualquer dano tecidual que possa comprometer a adequação da amostra para o diagnóstico confirmatório baseado em IHQ8. Para validar a integridade dos protocolos preparativos e dos resultados analíticos, as amostras de tecido positivas e negativas para EET são incluídas como controles em conjunto com a preparação de tecidos de casos de teste em cada ensaio.

Figura 1: O procedimento de IHC^{PrP Sc} . Representação mostrando o passo-a-passo do procedimento de IHQ^{PrP Sc} , desde a desparafinização dos cortes teciduais até a eventual imunomarcação e detecção (FFPE – Formalin-fixed paraffin-embedded; Mab – anticorpo monoclonal; DAB – 3,3′ diaminobenzidina). Esta figura foi criada em BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.