Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in <em>E. coli</em>

Luis Mota-Bravo; Manel Camps; Iv&#225;n Mu&#241;oz-Guti&#233;rrez; Andrey Tatarenkov; Caison Warner; Isabel Suarez; Gerardo Cort&#233;s-Cort&#233;s

doi:10.3791/64523

JoVE Journal > Genetics

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Genetics

الكشف عن نقل الجينات الأفقي بوساطة البلازميدات المترافقة الطبيعية في الإشريكية القولونية

Published: March 24, 2023

doi:

10.3791/64523

Luis Mota-Bravo¹, Manel Camps², Iván Muñoz-Gutiérrez¹, Andrey Tatarenkov¹, Caison Warner², Isabel Suarez¹, Gerardo Cortés-Cortés²

¹School of Biological Sciences,University of California Irvine, ²Department of Microbiology & Environmental Toxicology,University of California Santa Cruz

Summary

يتوسط الاقتران في نقل الجينات الأفقي عن طريق تعبئة الحمض النووي البلازميد عبر خليتين مختلفتين ، مما يسهل انتشار الجينات المفيدة. يصف هذا العمل طريقة مستخدمة على نطاق واسع للكشف الفعال عن نقل البلازميد الاقتراني ، بناء على استخدام العلامات التفاضلية في البلازميد المترافق والمتبرع والمتلقي للكشف عن الاقتران التبادلي.

Abstract

يمثل الاقتران إحدى الآليات الرئيسية التي تسهل نقل الجينات الأفقي في البكتيريا سالبة الجرام. يصف هذا العمل طرق دراسة تعبئة البلازميدات المترافقة التي تحدث بشكل طبيعي ، باستخدام اثنين من البلازميدات التي تحدث بشكل طبيعي كمثال. تعتمد هذه البروتوكولات على الوجود التفاضلي للعلامات القابلة للاختيار في البلازميد المتبرع والمتلقي والاقتران. على وجه التحديد ، تشمل الطرق الموصوفة 1) تحديد البلازميدات المترافقة الطبيعية ، 2) القياس الكمي لمعدلات الاقتران في الثقافة الصلبة ، و 3) الكشف التشخيصي للجينات المقاومة للمضادات الحيوية وأنواع ريبليكون البلازميد في المستقبلات عبر الاقتران بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تم تطوير البروتوكولات الموصوفة هنا في سياق دراسة البيئة التطورية لنقل الجينات الأفقي ، للكشف عن وجود البلازميدات المترافقة التي تحمل جينات مقاومة للمضادات الحيوية في البكتيريا الموجودة في البيئة. إن النقل الفعال للبلازميدات المترافقة التي لوحظت في هذه التجارب في الثقافة يسلط الضوء على الأهمية البيولوجية للاقتران كآلية تعزز نقل الجينات الأفقي بشكل عام وانتشار مقاومة المضادات الحيوية بشكل خاص.

Introduction

في عام 1946 ، وصف Lederberg و Tatum¹ عملية جنسية في الإشريكية القولونية K-12 تعرف الآن باسم الاقتران. الاقتران البكتيري هو العملية التي تنقل بها الخلية البكتيرية (المتبرع) المادة الوراثية أحادية الاتجاه إلى خلية أخرى (المتلقي) عن طريق الاتصال المباشر من خلية إلى خلية. يتم توزيع الاقتران على نطاق واسع في البكتيريا ^2,3 ، على الرغم من أن جزء الخلايا المانحة التي تعبر عن آلية الاقتران عادة ما يكون صغيرا جدا⁴.

البلازميدات تتكاثر بشكل مستقل عناصر الحمض النووي خارج الكروموسومات. بالإضافة إلى الجينات المشاركة في تكرار البلازميد وصيانته ، تحمل البلازميدات في كثير من الأحيان شحنة من الجينات المشاركة في التكيف مع التحديات البيئية ، مثل المعادن الثقيلة أو التعرض للمضادات الحيوية⁵. البلازميدات الاقترانية هي فئة من البلازميدات مع مجموعة من الجينات المتخصصة التي تسمح بنقلها إلى الخلايا المتلقية ودعم استمرارها بعد النقل⁶. تختلف البلازميدات المترافقة في الحجم من 21.8 كيلو بايت إلى 1.35 ميجا بايت في البكتيريا في شعبة Pseudomonadota (مرادف للبكتيريا البروتينية) ، مع متوسط حوالي 100 كيلو بايت ^5,7. لديهم أيضا بشكل عام عدد نسخ منخفض ، ربما للحفاظ على عبء التمثيل الغذائي على المضيف منخفضا ^8,9.

يتكون الجهاز الاقتراني النموذجي من أربعة مكونات: أصل النقل (oriT) ، والاسترخاء ، وبروتين اقتران من النوع الرابع ، ونظام إفراز من النوع الرابع (هيكل يشبه الأنبوب يسمى pilus يسمح للمتبرعين بالاتصال بالمتلقين)⁶. فقط جزء صغير جدا من الخلايا التي تحمل البلازميدات المترافقة تعبر عن آلية الاقتران⁴ ، ولكن إذا كانت البلازميدات توفر ميزة اللياقة البدنية ، يمكن أن تتوسع الاقتران بسرعة في السكان. ما بين 35٪ وأكثر من 80٪ من عزلات الإشريكية القولونية التي تم جمعها من موائل مختلفة لها بلازميدات مترافقة مع جينات تمنح مقاومة لمضاد حيوي واحد على الأقل^10,11 ؛ لذلك ، فإن نقل الجينات الأفقي بوساطة البلازميدات المترافقة هو آلية رئيسية تقود الانتشار العالمي للجينات المقاومة للمضادات الحيوية¹².

أظهرت تجارب التزاوج التي أجريت في المستنبتة المختبرية أن تردد الاقتران يتأثر بعوامل متعددة ، بما في ذلك طبيعة الخلايا المتلقية ، ومرحلة النمو ، وكثافة الخلية ، ونسبة المتبرع إلى المتلقي ، سواء تم الاقتران في الوسائط السائلة أو الصلبة ، والكربون ، والأكسجين ، والأملاح الصفراوية ، وتركيزات المعادن ، ووجود خلايا الثدييات ، ودرجة الحرارة ، ودرجة الحموضة ، وزمن التزاوج^13,14 ^،¹⁵.

يصف هذا العمل بروتوكولات للكشف عن وجود البلازميدات الاقترانية في سلالة مضيفة معينة ، لتحديد معدلات الاقتران في الثقافة الصلبة ، والتحقق مرة أخرى من نقلها إلى الخلايا المتلقية. يمكن استخدام هذه البروتوكولات كخطوة أولى لتحديد البلازميدات المترافقة الطبيعية المناسبة للبحث. يستخدمون الحد الأدنى من الخطوات المبسطة لأنهم مصممون لفحص وجود البلازميدات المترافقة في البكتيريا التي تم الحصول عليها من مصادر متعددة (بيئية ، متعايشة ، ومسببة للأمراض) على نطاق واسع (عشرات إلى مئات المتبرعين).

بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض اختبارات للكشف عما إذا كانت تعبئة بلازميد اقتراني معين مستقلة عن المضاد الحيوي المستخدم للكشف (أي أهمية جين مقاومة المضادات الحيوية قيد الاختيار) ومقارنة معدلات الاقتران لاثنين من البلازميدات المترافقة الموجودة في عزلات بيئية مختلفة.

استنادا إلى التركيب الجيني للبلازميدات المترافقة ذات الصلة (ريبليكون البلازميد والتركيب الجيني المقاوم للمضادات الحيوية) ، يمكن تعديل كل خطوة من خطوات البروتوكول لدراسة تأثير مجموعة متنوعة من العوامل التي من المحتمل أن تؤثر على معدل الاقتران.

التصميم التجريبي العام:
المكونات الأساسية اللازمة لإعداد تجربة التزاوج هي الخلايا المانحة ، والسلالة المتلقية ، والوسائط الصلبة لاختيار المتبرعين (المضاد الحيوي أ) ، والمتلقين (المضاد الحيوي ب) ، والمترافقات (المضادات الحيوية أ و ب). المرافقات العابرة هي خلايا متلقية تحافظ بثبات على البلازميد المترافق للمتبرع.

الخلايا المانحة مقاومة للمضاد الحيوي (المضاد الحيوي أ) وتكون عرضة للعلامة أو العلامات المستخدمة لاختيار الخلايا المتلقية (المضاد الحيوي ب). لا يجب معرفة الموقع الجينومي لجين مقاومة المضادات الحيوية (أي ما إذا كان موجودا في الكروموسوم أو بلازميد الخلية المانحة) مسبقا ، لأن تعبئة علامات مقاومة المضادات الحيوية إلى المتلقي (بعد اتصال مباشر بين المتبرع والمتلقي) تعني أن العلامات المقدمة من المتبرع كانت في البلازميد.

تحتاج السلالة المتلقية (المعروفة بأخذ البلازميدات الاقترانية) إلى علامة ثابتة قابلة للاختيار غير موجودة في المتبرع ؛ هذه العلامة القابلة للاختيار مقاومة بشكل عام للمضادات الحيوية أو المبيدات الحيوية الموجودة في الكروموسوم. يعد اختيار المتلقي الذي سيتم استخدامه في تجارب التزاوج أمرا بالغ الأهمية ، لأن بعض سلالات الإشريكية القولونية تختلف في قدرتها على تناول البلازميدات المترافقة¹⁶.

بمجرد إنشاء هذه المكونات ، فإن أي مستعمرة تنمو على الوسائط مع كل من المضادات الحيوية (A و B) بعد اتصال زوج من المتبرع والمتلقي هي ترافق مفترض (الشكل 1). هذا على افتراض أن المتبرعين يمكن أن ينمووا في وسط المضاد الحيوي A ولكن لا يمكنهم النمو في الوسائط مع المضاد الحيوي B ، وأن المتلقين قادرون على النمو في الوسائط مع المضاد الحيوي B ، ولكن غير قادرين على النمو باستخدام المضاد الحيوي A. يمكن تأكيد الاقتران باستخدام اختبارين تشخيصيين. يتكون الاختبار الأول من الكشف (عن طريق تضخيم تفاعل البلمرة المتسلسل [PCR] للجينات ، أو طرق أخرى) للجينات الموجودة في البلازميد الاقتراني في المستعمرات عبر الاقتران. يتضمن الاختبار الثاني استخدام علامات لون المستعمرة التفاضلية بناء على استقلاب اللاكتوز. يتم الكشف عن لون المستعمرة التفاضلية باستخدام أجار MacConkey. يمكن استخدام اللاكتوز الموجود في أجار كمصدر تخمير بواسطة الكائنات الحية الدقيقة التي تخمر اللاكتوز (^LAC+). تنتج هذه الكائنات الحية الدقيقة الأحماض العضوية ، وخاصة حمض اللاكتيك ، الذي يخفض درجة الحموضة. الأحمر المحايد هو مؤشر الأس الهيدروجيني المضمن في الوسائط التي تتحول من الأبيض الفاتح إلى الأحمر / الوردي الفاتح حيث ينخفض الرقم الهيدروجيني إلى أقل من 6.8¹⁷. وبالتالي ، فإن سلالات الإشريكية القولونية الإيجابية للاكتوز تنتج مستعمرات وردية أكبر على أجار MacConkey ، في حين أن السلالات السلبية اللاكتوز تنتج مستعمرات صفراء باهتة وأصغر على أجار MacConkey.

الشكل 1: تصميم تجريبي يستخدم للكشف عن وجود البلازميدات المترافقة في السلالات المانحة. في هذا المثال ، يحمل المتبرع بلازميدا مترافقا مع جين مقاوم للمضادات الحيوية يمنح مقاومة للمضاد الحيوي A ، لكنه عرضة للمضاد الحيوي B. على العكس من ذلك ، فإن المتلقي لديه محدد مقاومة الكروموسومات الذي يمنح الحماية من المضادات الحيوية B ، لكنه عرضة للمضاد الحيوي A. Transconjugants مقاومة لكل من المضادات الحيوية (A و B) ، لأن لديهم البلازميد الاقتراني للمتبرع الذي يمنح مقاومة للمضاد الحيوي A وكروموسوم المتلقي الذي يمنح الحماية من المضاد الحيوي B. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ويمكن حساب معدل الاقتران لزوج من المانحين والمتلقين (في ظل ظروف تجريبية معينة) بقسمة عدد الاقتران على عدد المتبرعين أو على عدد المتلقين؛ يشير المعدل الأول إلى جزء الخلايا المانحة التي تظهر تعبيرا وظيفيا لآلية الاقتران من قبل المتبرع^16,18 ، بينما يشير المعدل الثاني إلى قدرة المتلقي على أخذ البلازميدات المترافقة ^19,20. في هذه الدراسة ، ما لم ينص على خلاف ذلك ، يمثل معدل الاقتران جزء الخلايا المتلقية التي تصبح مترافقة (أي معدل لكل مستلم).

هنا ، تم الإبلاغ عن تجربتين مستقلتين للتزاوج ، شملت متلقيا واحدا للإشريكية القولونية واثنين من المتبرعين بالإشريكية القولونية. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام مضادات حيوية مختلفة لاختيار ترانسكونوجينات لأحد المتبرعين للتأكد من أنه يمكن اختيار بلازميد واحد مقاوم للأدوية المتعددة مع أي من الجينات المقاومة للمضادات الحيوية الموجودة في البلازميد المقترن.

تم تسلسل سلالات المانحين والمتلقين المستخدمة في هذا العمل بشكل كامل لفهم جميع مكونات هذا النظام التجريبي. ومع ذلك ، تم تصميم هذه البروتوكولات لفحص وجود البلازميدات المترافقة في مضيفات ذات تسلسل غير معروف ، ويمكن استخدامها في هذا السياق التجريبي أيضا. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، يتم تسلسل الجينات ذات الصلة أولا.

السلالات المانحة والمتلقية المستخدمة في البروتوكول هي كما يلي:

المتبرع 1. الإشريكية القولونية تم جمع SW4955 في بحيرة في باتون روج (لوس أنجلوس ، الولايات المتحدة الأمريكية). يحتوي على بلازميد اقتراني 134,797 bp (p134797) مع ردود IncFIC (FII) و IncFIB (AP001918). يحتوي هذا البلازميد الاقتراني على جينات تمنح مقاومة للجيل الثالث من السيفالوسبورينات (bla_CTX-M-55) ، أمينوغليكوزيدات (aac (3) -IIa و aadA1) ، فينيكول (catA2) ، التتراسيكلين (tet (A)) ، تريميثوبريم (dfrA14) ، والسلفوناميدات (sul3). للحصول على خريطة كاملة ل p134797 ، يرجى الاطلاع على الشكل 2A. الإشريكية القولونية SW4955 إيجابي اللاكتوز ، وينتج مستعمرات وردية على أجار MacConkey.

المتبرع 2. الإشريكية القولونية تم جمع SW7037 في بحيرة إيري (مقاطعة أوتاوا ، أوهايو ، الولايات المتحدة الأمريكية). يحمل بلازميد اقتراني 101,718 bp (p101718) مع replicon IncI1-I (Alpha). يحتوي هذا البلازميد المترافق على جين يمنح مقاومة لبيتا لاكتام (bla_CMY-2). للحصول على خريطة كاملة ل p101718 ، يرجى الاطلاع على الشكل 2B. الإشريكية القولونية SW7037 هو أيضا إيجابي اللاكتوز ، وينتج مستعمرات وردية على أجار MacConkey.

الشكل 2: الخريطة الجينية للبلازميدات الاقترانية المستخدمة في هذه الدراسة. أ: البلازميد p134797، البلازميد الاقتراني الموجود في سلالة الإشريكية القولونية SW4955. ب: البلازميد p101718، البلازميد الاقتراني الموجود في سلالة الإشريكية القولونية SW7037. يتم تمييز الجينات المقاومة للمضادات الحيوية باللون الأزرق ، ويتم تمييز الجينات التي تنتمي إلى الجهاز الاقتراني باللون الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المستلم. الإشريكية القولونية يتم استخدام LMB100 كمستلم. هذه سلالة عديمة البلازميد مقاومة للريفامبين (100 مجم / لتر) والستربتومايسين (100 مجم / لتر). إن وجود مقاومة لاثنين من المضادات الحيوية يقلل من احتمال حدوث طفرات المقاومة في المتبرع والتي من شأنها أن تتداخل مع تفسير النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، فإن E. coli LMB100 سلبي اللاكتوز ، ويمكن تمييزه عن السلالتين المانحتين لأنه ينتج مستعمرات صفراء شاحبة وصغيرة (على عكس المستعمرات الوردية الكبيرة) على MacConkey agar.

عندما يكون المتبرع سلبي اللاكتوز ، نوصي باستخدام متلقي إيجابي اللاكتوز (على سبيل المثال ، E. coli J53). سلالات LMB100 و J53 متاحة للمختبرات الأخرى للاستخدام. يرجى إرسال طلب إلى الدكتور جيراردو كورتيس كورتيس مع العنوان ورقم فيديكس.

الوسائط الصلبة اللازمة لاختيار وإحصاء المتبرعين والمتلقين والمرافقين هي MacConkey agar في أطباق بتري التي يبلغ قطرها 100 مم. هناك حاجة إلى إضافة المضادات الحيوية التالية: (i) الوسائط A: كاربينيسيلين (100 مجم / لتر) لإحصاء المتبرعين ولضمان عدم تمكن المتلقين من النمو باستخدام هذا المضاد الحيوي. (ii) الوسائط B: ريفامبين (100 ملغم / لتر) + ستربتومايسين (100 ملغ / لتر) لإحصاء المتلقين وضمان عدم قدرة المتبرعين على النمو في هذين المضادات الحيوية. (iii) Media AB: كاربينيسيلين (100 ملغم/لتر) + ريفامبين (100 ملغم/لتر) + ستربتومايسين (100 ملغم/لتر) للحصول على المواد المترافقة وعدها. (iv) الوسائط C: لا توجد مضادات حيوية لربط جميع العزلات المدروسة.

تمت مقارنة معدلات اقتران البلازميدات الاقترانية من E. coli SW4955 و E. coli SW7037 إلى E. coli LMB100. بالإضافة إلى ذلك ، في حالة البلازميد الاقتراني p134797 (سلالة SW4955) ، يتم استبدال كاربينيسيلين المضاد الحيوي (100 مجم / لتر) بالجنتاميسين (2 مجم / لتر) ، الكلورامفينيكول (25 مجم / لتر) ، التتراسيكلين (10 مجم / لتر) ، تريميثوبريم (20 مجم / لتر) ، أو سلفاميثوكسازول (100 مجم / لتر) في التجارب اللاحقة لتحديد ما إذا كانت علامة مقاومة المضادات الحيوية المستخدمة للاختيار لها أي تأثير على النتائج.

Protocol

1. الطريقة الأولى: الاقتران يوم 1: خط المتبرعين والمتلقي. خط منفصل عن مخزون الجلسرين على الوسائط C (أجار MacConkey بدون مضادات حيوية) ، واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية.ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لضمان إجراء التجربة باستخدام عزلات نقية ولتأكيد النمط الظاهري للاكتوز حسب لون المستعمرات. اليوم 2: قم بتسمية أنبوب مزرعة سعة 14.0 مل لكل متبرع ومتلقي. حدد مستعمرة واحدة لكل متبرع ومتلقي ، وقم بزراعتها طوال الليل (18 ساعة) في أنابيب استزراع منفصلة سعة 14.0 مل تحتوي على 2 مل من مرق مولر هينتون عند 37 درجة مئوية وتهتز عند 200 دورة في الدقيقة.ملاحظة: في السلالات المستخدمة ، يتم الوصول إلى المرحلة الثابتة بعد الاستزراع الليلي لمدة 18 ساعة. اليوم 3: قم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) للثقافة الليلية لكل متبرع ومتلقي (بدون دوامة) باستخدام تخفيف 1:10 من 900 ميكرولتر من محلول ملحي و 100 ميكرولتر من المزرعة الليلية. اضبط الكثافة البصرية لكل متبرع ومتلقي إلى 2.0 (OD600 = 2.0) بمحلول ملحي معقم (0.85٪ كلوريد الصوديوم في الماء).ملاحظة: تحتوي مزرعة الإشريكية القولونية الليلية مع OD600 = 2.0 على 1.6 × 109 CFU / mL. قم بتسمية أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل “أنبوب التزاوج” ، مع الإشارة إلى سلالات المتبرع والمتلقي. نقل 500 ميكرولتر من المعلق المعدل (OD600 = 2.0) لكل متبرع ومتلقي ، ووضعها في أنبوب التزاوج (سيكون لأنبوب التزاوج هذا 0.8 × 109 CFU / mL لكل متبرع ومتلقي). خلط بلطف أنبوب التزاوج عن طريق الانقلاب. جهاز طرد مركزي أنبوب التزاوج لمدة 10 دقائق عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة. دون إزعاج الحبيبات ، ماصة خارج 800 ميكرولتر من أنبوب الاقتران. يجب أن يكون هناك 200 ميكرولتر متبقي في أنبوب الاقتران.ملاحظة: تخلص من المادة الطافية في حاوية مبيض بنسبة 10٪ لتعطيل البكتيريا في التعليق. احتضان أنبوب التزاوج لمدة 18 ساعة (بين عشية وضحاها) عند 37 درجة مئوية في حاضنة. يحدث التزاوج خلال فترة الحضانة.ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة دون اهتزاز حتى لا تنكسر البيلي الاقتراني. كعنصر تحكم سلبي ، قم بخط الثقافة الليلية للمانحين على الوسائط B والمتلقين على الوسائط A. احتضان الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية اليوم 4: أضف 800 ميكرولتر من المحلول الملحي إلى أنبوب التزاوج والدوامة لإعادة التعليق (هذا يعيد تكوين مزيج التزاوج إلى 1 مل).ملاحظة: الدوامة تكسر بكتيريا التزاوج وتجانس الثقافة لتحديد CFU / mL. تحضير 1:10 التخفيفات (من 1 × 100 إلى 1 × 10-7) من مزيج التزاوج. لوحة 100 ميكرولتر من التخفيفات 10-5 إلى 10-7 على الوسائط A والوسائط B ، وجميع التخفيفات على الوسائط AB.ملاحظة: يشير التخفيف 100 إلى الأنبوب الأنيق. اترك الألواح تجف قبل وضعها في الحاضنة رأسا على عقب. احتضان الألواح لمدة 18 ساعة (بين عشية وضحاها) عند 37 درجة مئوية. اليوم 5: فحص الضوابط السلبية للتأكد من أن خطوط الثقافات البحتة بين عشية وضحاها من المانحين لم تنمو على وسائل الإعلام B ، وأن ثقافة المتلقين بين عشية وضحاها النقية لم تنمو على وسائل الإعلام A. سجل عدد المستعمرات والتخفيفات التي يمكن حسابها:عد المستعمرات في الوسائط أ ؛ هؤلاء هم المانحون. يجب أن تكون المستعمرات وردية (الشكل 3 أ ، ب). عد المستعمرات في الوسائط B ؛ هؤلاء هم المتلقون والمترافقون. يجب أن تكون المستعمرات صفراء شاحبة (الشكل 3 ج). عد المستعمرات في وسائل الإعلام AB ؛ هذه هي المترافقات. يجب أن تكون المستعمرات صفراء شاحبة.ملاحظة: حدد لوحة قابلة للعد. تحتوي اللوحة القابلة للعد على ما بين 30 و 300 مستعمرة (سيكون من الصعب حساب أكثر من 300 مستعمرة ، ويعتبر أقل من 30 مستعمرة حجم عينة صغيرا جدا لتقديم تمثيل دقيق للعينة الأصلية). حساب تكرار الاقتران لكل متبرع أو لكل متلقيتواتر الاقتران لكل متبرع = (CFU / mL للمرافقة [media AB]) / (CFU / mL للمتبرعين [الوسائط A]) × 100تردد الاقتران لكل مستلم = (CFU / mL للمقترن [media AB]) / (CFU / mL للمستلمين والمرافقات [الوسائط B]) × 100ملاحظة: تم حساب تردد الاقتران لهذا البروتوكول على أنه مترافقات مقسومة على عدد المستلم ، مضروبة في 100. وفقا للأدبيات ، يمكن تسمية الكمية الناتجة من الاقتران على أنها تردد الاقتران ، تردد نقل الجينات ، تردد الاقتران ، العائد المؤتلف ، كفاءة نقل البلازميد ، تردد الاقتران بناء على إجمالي عدد البكتيريا ، نسبة الاقتران العابر ، جزء من الاقتران في السكان المتلقين ، تردد الاقتران ، تردد الاقتران ، لوغاريتم معدل الاقتران ، ثابت معدل النقل ، معدل الاقتران لكل زوج تزاوج ، معامل الاقتران ، أو كفاءة الاقتران20. يشير هذا البروتوكول إلى مصطلح كفاءة الاقتران. قم بتخزين المترافقات في مخزون الجلسرين عند -80 درجة مئوية. اتبع الخطوات الفرعية لإعداد مخزون الجلسرين.اختر مستعمرة واحدة من الاقتران وقم بزراعتها طوال الليل (18 ساعة) في أنابيب استزراع سعة 5.0 مل تحتوي على 2 مل من مرق مولر هينتون المكمل بالكاربينيسيلين (100 مجم / لتر) ، عند 37 درجة مئوية ورجها عند 200 دورة في الدقيقة. تسمية قوارير المبردة ، مع الإشارة إلى اسم transconjugant ، على النحو التالي: Tc + اسم المتبرع + مضاد حيوي للاختيار في الوسائط A (نظرا لأنها مترافقات ، فمن المعروف أن خلفيتها هي السلالة المتلقية ، والتي تقاوم بالفعل الستربتومايسين والريفامبين ولكنها تؤوي بالإضافة إلى ذلك البلازميد الذي يحمل جين مقاومة بيتا لاكتام) ؛ على سبيل المثال ، TcU1Carb. أضف أرقاما متصلة في حالة الحاجة إلى تخزين أكثر من محول واحد من نفس المتبرع (على سبيل المثال ، TcU1Carb1 ، TcU1Carb2 ، إلخ). نقل 1 مل من مزرعة بين عشية وضحاها إلى 1 مل من 50٪ الجلسرين (v / v ؛ يجب أن يكون تركيز الجلسرين النهائي 25 ٪) وتخلط بلطف عن طريق الانقلاب. ضع القوارير المبردة على الثلج الجاف لمدة 15 دقيقة وقم بتخزين الكريوفيال عند -80 درجة مئوية للتجارب المستقبلية. لاستخراج الحمض النووي ، قم بخط تراسناقتير من مخزون الجلسرين على أجار مولر هينتون المكمل بالكاربينيسيلين (100 مجم / لتر) ، واحتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية. ثم اتبع التوصيات الواردة في الخطوة 2.1. 2. الطريقة الثانية: تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم الجينات المقاومة للمضادات الحيوية وريبليكون البلازميد في مترافقات الإشريكية القولونية ملاحظة: تم تطوير تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من قبل الدكتور كاري موليس في عام 1983. يعتمد تفاعل البوليميراز المتسلسل على بادئات محددة (قطعة قصيرة من الحمض النووي مكمل لتسلسل DNA معين يعمل كنقطة يمكن أن يستمر عندها النسخ المتماثل ، بشكل عام 20-40 نيوكليوتيدات في الطول وبشكل مثالي مع محتوى جوانين سيتوزين بنسبة 40٪ -60٪) ، والتي يتم تلدينها إلى خيوط متقابلة من قالب الحمض النووي المشوه والمزدوج الذي تقطعت به السبل ويمتد من خلال بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارة ، وبالتالي توليد قالب إضافي للدورة التالية من التفاعلات ، مما يؤدي إلى التضخيم الأسي للقالب الأصلي21. في هذا البروتوكول ، تم تضخيم replicons وجينات المقاومة الموجودة في البلازميدات المترافقة لتأكيد النقل في الخلايا المتلقية عبر المرافق. استخراج الحمض النوويللكشف عن نقل جينات المقاومة التي تحملها البلازميدات المترافقة ، استخدم الحمض النووي المترافق كقالب. استخدم الاستخراج البسيط للغليان التحضيري لتحلل جدران الخلايا البكتيرية.ملاحظة: الاستخراج البسيط للغليان هو طريقة بسيطة لتحلل جدران الخلايا البكتيرية. يحتوي هذا الاستخراج على الحمض النووي البلازميد الممزوج بالحمض النووي الجينومي ، ولكن نظرا لأن البادئات مصممة وفقا لتسلسلات الحمض النووي المحددة ذات الأهمية ، فإن هذا القالب مفيد أيضا لتفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن أيضا تنقية البلازميدات على وجه التحديد ، على الرغم من أن الغلة تميل إلى الانخفاض مع زيادة حجم البلازميد22. هذه نقطة توقف مريحة. يمكن تخزين الحمض النووي لعدة أشهر عند -20 درجة مئوية. تفاعل البوليميراز المتسلسلإذا كانت التجربة تحتوي على عنصر تحكم سلبي وتحكم موجب، فمن المفيد إعداد تجمع لجميع التفاعلات في أنبوب حجمه 1.5 mL. قم بتسمية أنبوب سعة 1.5 مل باسم “تجمع” وأنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل المطلوبة باسم الجين والعينة (على سبيل المثال ، OXA-U1). ماصة كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل بالترتيب التالي في أنبوب 1.5 مل: ماء معقم ، 2x Master Mix ، باديمر ، وبوليميراز (باستثناء قالب DNA) (انظر الجدول 1). امزج برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل. الحفاظ على الجليد طوال الوقت.ملاحظة: ارتد قفازات لتجنب تلويث خليط التفاعل أو الكواشف. حاول تجنب فتح وخلط الكواشف والتعامل مع العينات في نفس المنطقة لمنع تلوث الكاشف. ضع الكواشف في دلو الثلج لقمع نشاط النيوكلياز والتحضير غير المحدد. دعهم يذوبون تماما قبل إعداد رد فعل. احتفظ بالكواشف على الجليد طوال التجربة. يضاف تاك بوليميراز في النهاية لأنه حساس لتغيرات الأس الهيدروجيني. يجب أن يتم تخزينه مؤقتا لتجنب التدهور أو الطي. يتم سرد تسلسل البادئات في الجدول 2 – الجينات المقاومة للمضادات الحيوية – والجدول 3 – replicons 23،24،25،26،27،28. أضف قالب DNA إلى الأنبوب المقابل. تجنب إدخال الفقاعات والأغطية الآمنة على أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل. ضع أنابيب PCR في جهاز التدوير الحراري. بدء تشغيل البرنامج. راجع إعدادات البرنامج المدرجة لكل جين في الجدول 2 (جينات المقاومة) والجدول 3 (الردود).ملاحظة: اضبط برامج تفاعل البوليميراز المتسلسل للاحتفاظ بالعينات عند 4 درجات مئوية بعد التشغيل.شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل للرد: دورة واحدة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، تليها 30 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، والتلدين عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، واستطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، وتمديد نهائي لدورة واحدة عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.ملاحظة: هذه هي الشروط التي تم توحيدها بواسطة Carattoli et al.29. عند انتهاء البرنامج ، قم بتخزين أنابيب PCR عند 4 درجات مئوية.ملاحظة: هذه نقطة توقف مريحة. يمكن تخزين منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لعدة أشهر عند -20 درجة مئوية قم بإعداد جل أغاروز 1٪ بوزن 0.6 جم من الأغاروز في دورق سعة 250 مل وإضافة 60 مل من 1x Tris-acetate-EDTA (TAE) عازلة (اضبط الكواشف إذا كانت هناك حاجة إلى حجم هلام مختلف). قم بإذابة الأغاروز بعناية وببطء في الميكروويف لتجنب انسكاب الأغاروز على القارورة ، واتركه يبرد إلى حوالي 55 درجة مئوية (10-15 دقيقة).تحضير جميع الكواشف باستخدام الماء منزوع الأيونات عالي النقاء والكواشف التحليلية: TAE 50x Buffer (قاعدة Tris وحمض الخليك و EDTA) (1 لتر): امزج 121.1 جم من قاعدة Tris + 372.24 جم من EDTA ، وأضف 500 مل من الماء المقطر. تذوب مع النمام المغناطيسي. أضف 57.1 مل من حمض الأسيتيك ، وأضف الماء المقطر إلى حجم إجمالي قدره 1000 مل. الأوتوكلاف عند 15 رطل / بوصة مربعة ، 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ويحفظ في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح جاهزا لمدة تصل إلى 6 أشهر. TAE 1x Buffer (1 لتر): امزج 20 مل من محلول TAE 50x مع 980 مل من الماء المقطر واخلطه. تحت غطاء الدخان ، أضف 6 ميكرولتر من SYBR Green إلى الأغاروز المذاب ، واخلطه واسكبه في الدرج (والمشط) ، مختوم مسبقا بشريط لاصق لتجنب الانسكاب. دع الجل يضبط لمدة 15-25 دقيقة حتى يظهر التعكر.ملاحظة: تتوفر أيضا أصباغ بديلة أخرى30،31،32،33. قم بإزالة الشريط اللاصق ووضع الجل في غرفة الرحلان الكهربائي ، مع إضافة ما يكفي من 1x TAE buffer لتغطية الجل. امزج 5 ميكرولتر من صبغة تحميل هلام الحمض النووي 6x مع 25 ميكرولتر من كل تفاعل. امزج برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل.ملاحظة: لا يلزم تحميل كل منتج PCR في الجل لتصور المنتج المتوقع (اضبط كمية الصبغة كما يتوافق). يمكن حفظ عينة تفاعل البوليميراز المتسلسل المتبقية وتخزينها في -20 درجة مئوية لعدة أشهر. قم بتحميل المزيج في الآبار (تجنب إدخال الفقاعات) وضع غطاء الحجرة لأسفل.ملاحظة: قم بتحميل العينة الأولى في البئر الثانية (احتفظ بالعينة الأولى على السلم) ، بدءا من عنصر التحكم السلبي. قم بتحميل 4 ميكرولتر من سلم الحمض النووي 1 كيلو بايت في البئر الأول. قم بتشغيل الكهربائي عند 120 فولت و 400 مللي أمبير و 60 دقيقة. تصور الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية) وتسجيل الصورة.ملاحظة: في حالة وجود منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يمكن اكتشاف نطاقات الحمض النووي الملطخة باستخدام مصباح محول قياسي للأشعة فوق البنفسجية أو مصباح ضوئي مرئي أو ماسح ضوئي قائم على الليزر. الكاشف حلول الأسهم الحجم المضاف إلى تفاعل 50 ميكرولتر (1x) نهائي مثال: الحجم مثال: الحجم مثال: الحجم المضاف إلى كل أنبوب Final Vol. 50 μL تمت إضافة مستوى الصوت إلى التحكم الإيجابي تمت إضافة مستوى الصوت إلى التحكم السلبي تركيز تمت الإضافة إلى 1x تمت الإضافة إلى 3x (مسبح) الماء المعقم – 21.5 ميكرولتر (q.s. إلى 50 ميكرولتر) – 21.5 ميكرولتر 64.5 ميكرولتر 49 ميكرولتر / أنبوب 49 ميكرولتر / أنبوب 49 ميكرولتر / أنبوب ماستر ميكس 2x 25 ميكرولتر 1x 25 ميكرولتر 75 ميكرولتر التمهيدي إلى الأمام 25 ميكرومتر 1 ميكرولتر 0.5 ميكرومتر 1 ميكرولتر 3 ميكرولتر التمهيدي العكسي 25 ميكرومتر 1 ميكرولتر 0.5 ميكرومتر 1 ميكرولتر 3 ميكرولتر قالب الحمض النووي متغير (100-200 نانوغرام / ميكرولتر) متغير (1 ميكرولتر) متغير 0.5 ميكرولتر 1.5 ميكرولتر البلمرة 5 وحدات / ميكرولتر 0.5 ميكرولتر 2.5 وحدة – – 1 ميكرولتر (مترافق) 1 ميكرولتر (مانح) 1 ميكرولتر (مستلم) ملاحظة: q.s. هو اختصار لاتيني ل satis الكمومي يعني المبلغ المطلوب. الجدول 1: كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل وتجمع لثلاثة تفاعلات (مثال). الاشعال (التسلسل مدرج في الاتجاه 5 ‘- 3′) برنامج PCR الحجم المتوقع (ب) الرقم المرجعي. مجموعة بي لاCTX-M 1 94 درجة مئوية7 دقائق (864) 23 CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC 94 درجة مئوية50 ثانية (35 دورة) CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC 50 درجة مئوية40 ثانية 68 درجة مئوية1 دقيقة 68 درجة مئوية5 دقائق blaCMY-2 95 درجة مئوية3 دقائق (1855) 24 CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG 95 درجة مئوية30 ثانية (30 دورة) CMY-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC 53 درجة مئوية30 ثانية 72 درجة مئوية30 ثانية 72 درجة مئوية3 دقائق aac(3’)-II 94 درجة مئوية5 دقائق (237) 25 AAC (3 ‘) -II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC 94 درجة مئوية30 ثانية (32 دورة) AAC (3’) -II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA 60 درجة مئوية45 ثانية 72 درجة مئوية2 دقيقة 72 درجة مئوية8 دقائق aadA 94 درجة مئوية5 دقائق (283) 26 aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG 94 درجة مئوية1 دقيقة (35 دورة) aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTGG 60 درجة مئوية1 دقيقة 72 درجة مئوية1 دقيقة 72 درجة مئوية8 دقائق سول-3 94 درجة مئوية5 دقائق (799) 27 سول-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG 94 درجة مئوية1 دقيقة (30 دورة) سول-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA 51 درجة مئوية1 دقيقة 72 درجة مئوية1 دقيقة 72 درجة مئوية5 دقائق تيت (أ) 95 درجة مئوية5 دقائق (957) 28 TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC 95 درجة مئوية30 ثانية (23 دورة) TETA-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT 62 درجة مئوية30 ثانية 72 درجة مئوية45 ثانية 72 درجة مئوية7 دقائق دفر A 95 درجة مئوية5 دقائق (302) هذا العمل DFRA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG 95 درجة مئوية1 دقيقة (30 دورة) 55 درجة مئوية1 دقيقة DFRA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG 72 درجة مئوية1 دقيقة 72 درجة مئوية7 دقائق كات أ 2 95 درجة مئوية5 دقائق catA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTCTTTTCTC 95 درجة مئوية1 دقيقة (25 دورة) (225) هذا العمل catA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT 60 درجة مئوية1 دقيقة 72 درجة مئوية1 دقيقة 72 درجة مئوية7 دقائق الجدول 2: البادئات وبرامج تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدمة لتضخيم جينات المقاومة التشخيصية. ريبليكون التمهيدي (التسلسل مدرج في الاتجاه 5 ‘- 3’) هدف برنامج PCR الحجم المتوقع (bp) إنك فيب F: TCTGTTTATTCTTACTGTCCAC ريبا 94 درجة مئوية5 دقائق 683 R: CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT 94 درجة مئوية1 دقيقة (30 دورة) 60 درجة مئوية30 ثانية إنك إف آي سي F: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG ريبا2 72 درجة مئوية1 دقيقة 262 R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT 72 درجة مئوية5 دقائق IncI1 F: CGAAAGCCGGACGGCAGAA رناي 139 R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT الجدول 3: البادئات وبرنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدم لتصنيف البلازميدات p134797 و p101718 بواسطة كتابة replicon القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل29.

Representative Results

بالنظر إلى أن المتبرعين SW4955 و SW7037 قد تم تسلسلهما ، فمن المتوقع أن يكون لهاتين السلالتين المانحتين الأنماط الظاهرية المقاومة المقابلة لملف تعريف جين المقاومة المحدد في تسلسلهما الجينومي. يحتوي Plasmid p134797 (من SW4955) على جينات تمنح مقاومة للجيل الثالث من السيفالوسبورينات (blaCTX-M-55) ، ومقاومة للأمينوغليكوزيدات (aac (3) -IIa و aadA1) ، الفينيكول (catA2) ، التتراسيكلين (tet (A)) ، تريميثوبريم (dfrA14) ، والسلفوناميدات (sul3) ؛ لم يتم العثور على جينات مقاومة للمضادات الحيوية في كروموسوم SW4955. يحمل Plasmid p101718 (من SW7037) جينا واحدا فقط لمقاومة المضادات الحيوية (bla CMY-2) ، ومن المتوقع أن يمنح مقاومة للجيل الثالث من السيفالوسبورينات (blaCTX-M-55). مرة أخرى لم يتم العثور على جينات مقاومة للمضادات الحيوية في كروموسوم SW7037. بعد التزاوج ، كان من المتوقع اكتشاف نقل البلازميدات المترافقة التي تحمل جميع جينات المقاومة المذكورة أعلاه. يشير اكتشاف الاقتران الإيجابي إلى أن المتلقين الذين تم تحديدهم على أنهم ترانسكونارت يجب أن يكونوا قد اكتسبوا البلازميدات الاقترانية. كان من المتوقع أيضا وجود جينات المقاومة التشخيصية للبلازميدات المترافقة في المترافقات (كما تم اكتشافها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل). لتوضيح الطرق الموضحة هنا ، تم اختبار قدرة عزلتين بيئيتين من الإشريكية القولونية على نقل الحمض النووي البلازميد عن طريق الاقتران. يظهر تمثيل تخطيطي للإعداد التجريبي في الشكل 1. تم تزاوج اثنين من المتبرعين (E. coli SW4955 و SW7037) ومتلقي واحد (E. coli LMB100) بشكل مستقل. يوضح الشكل 2 الخريطة الجينية للبلازميدات المترافقة الموجودة في الإشريكية القولونية SW4955 (p134797) وSW7037 (p101718). تم اختيار البلازميدات الاقترانية مع الكربينيسيلين واختيارها باستخدام ريفامبين والستربتومايسين ، والتي توجد محددات مقاومتها في كروموسوم المتلقي. تم استخدام MacConkey agar لتمييز المتبرعين إيجابيي اللاكتوز (الذين ينتجون مستعمرات كبيرة وردية) من المتلقي و transconjuants (التي تكون سلبية اللاكتوز وتنتج مستعمرات صفراء شاحبة أصغر) (الشكل 3). الشكل 3: رسم توضيحي لعلامات الألوان التفاضلية لمستعمرات المانحين والمتلقين على أجار MacConkey. المستعمرات المقابلة للمتبرعين وردية اللون على أجار MacConkey لأنها إيجابية اللاكتوز. هذا يميز المتبرع عن المستعمرات المتلقية ، والتي تكون صفراء شاحبة وأصغر (سلبية اللاكتوز). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تم الكشف عن تعبئة البلازميد الاقتراني p134797 ، مع كل من المضادات الحيوية الخمسة المقابلة للفئات الخمس المختلفة من جينات المقاومة الموجودة في البلازميد. يتم تقديم مثال على كيفية حساب كفاءة الاقتران (CE) للسلالة SW4955. من الفحص مع سلالة SW4955 ، تم حساب 172 CFU من transconjuants في اللوحة من التخفيف 10-2 ؛ كان عدد المتلقي من التخفيف المقابل (10-2) 10,300,000 CFU / مل (الجدول 4). يتم حساب CE على النحو التالي: CE = (174 CFU / مل) / (10,300,000 CFU / مل) CE = 1.67 × 10-5 مترافقات / مستلم ل مب 100 ترانسكونكورات من سلالة SW4955 مختارة مع كاربليسيلين كفاءة الاقتران التخفيف CFU (لوحة قابلة للعد) تقريبا.CFU / مل CFU (لوحة قابلة للعد) 100 متلاقى 1.03E+09 10-1 متلاقى 1.03E+08 10-2 متلاقى 10300000 172 1.67 × 10-5 مترافقات / مستلم 10-3 متلاقى 1030000 10-4 متلاقى 103000 10-5 متلاقى 10300 10-6 متلاقى 1030 10-7 103 103 يتم تمييز القيم المستخدمة لحساب CE بالخط العريض. الجدول 4: مثال على كيفية حساب كفاءة الاقتران (CE) للسلالة SW4955. تظهر النتائج في الجدول 5 ، معبرا عنها بكفاءة الاقتران لكل مستلم. كانت كفاءات الاقتران الخمسة التي تم الحصول عليها باستخدام السلالة SW4955 كمتبرع كلها ضمن نفس الترتيب من حيث الحجم. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن الكشف عن تعبئة البلازميد الاقتراني بغض النظر عن الاختيار المستخدم لتحديد هوية الاقتران المرافق. باستخدام السلالة SW7037 كجهة مانحة ، كانت كفاءة الاقتران التي تم الحصول عليها أقل بثلاث مرات. تسمح هذه النتائج بمقارنة كفاءات الاقتران لمختلف الجهات المانحة وأنواع البلازميد مع نفس المتلقين. كفاءة الاقتران وتر كاربينيسيلين (100 ملغم/لتر) جنتاميسين (2 ملغ/لتر) الكلورامفينيكول (25 ملغم/لتر) التتراسيكلين (10 ملغم/لتر) تريميثوبريم (20 ملغ/لتر) SW4955 1.67 س 10-5 5.67 س 10-5 2.17 س 10-5 7.62 س 10-5 1.36 س 10-5 SW7037 2.14 س 10-6 الجدول 5: كفاءات اقتران سلالات المتبرعين بالإشريكية القولونية SW4955 و SW7037 اعتمادا على المضاد الحيوي المستخدم في الاختيار. في الاقتران ، تم فحص وجود replicons وجميع جينات المقاومة المشفرة في اثنين من البلازميدات الاقترانية التي تم اختبارها ، والردود المقابلة لها ، بواسطة PCR. يوضح الجدول 3 الظروف المستخدمة لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل التشخيصية هذه. المواد الهلامية التشخيصية موضحة في الشكل 4. تؤكد هذه المواد الهلامية وجود replicons المتوقعة في الاقتران (IncFIC و IncFIB في p1347975 ، و IncI1 في p101718). كما أنها تؤكد وجود جينات مقاومة المضادات الحيوية المتوقعة ، وهي مجموعة bla CTX-M-55 (بيتا لاكتام) ، و aac (3) -II و aadA (أمينوغليكوزيد) ، و catA2 (فينيكول) ، و tet (A) (التتراسيكلين) ، و dfrA14 (تريميثوبريم) ، و sul3 (السلفوناميد) ل p1347975 ، و blaCMY-2 ل p101718 (الشكل 4). الشكل 4: المواد الهلامية التشخيصية للرحلان الكهربائي. هلام الكهربائي من منتجات PCR من الجينات المقاومة للمضادات الحيوية و replicons البلازميد وجدت في البلازميدات المترافقة p134797 و p101718 في الخلايا المانحة (سلالات SW4955 و SW7037 ، على التوالي) وفي الترانسكونجوجات LMB100 المقابلة. تم استخدام Carbenicillin لاختيار البلازميد. الاختصارات. -: السيطرة السلبية (تم استخدام الحمض النووي للسلالة LMB100 كعنصر تحكم سلبي) ؛ د: المانح. T: مترافق. أحجام amplicon المتوقعة: blaCTX-M-55: 864 pb ؛ aac(3)-IIa: 237 نقطة أساس; aadA1: 283 نقطة أساس ؛ catA2: 225 نقطة أساس ؛ تيت (أ): 957 نقطة أساس ؛ dfrA14: 302 نقطة أساس ؛ SUL3: 799 BP ؛ IncFIC(FII): 262 نقطة أساس; IncFIB: 683 نقطة أساس. blaCMY-2: 1855 نقطة أساس ؛ IncI1-I: 139 نقطة أساس. يحتوي الجل على 1٪ أغاروز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

توفر البلازميدات الاقترانية الوصول إلى مجموعة مشتركة من الجينات داخل بيئة بيئية معينة من خلال إعادة التركيب ونقل الجينات الأفقي³⁴. وبالتالي ، فإن البلازميدات المترافقة هي كيانات تطورية قادرة على اكتساب ومنح الوظائف التي تسمح للبكتيريا بالتكيف مع ظروف متعددة (بما في ذلك مقاومة المضادات الحيوية ، ومقاومة المعادن ، واكتساب المعادن ، وتكوين الأغشية الحيوية ، والجينات المسببة للأمراض ، من بين أمور أخرى) في غضون ساعات زمنية.

يقدم هذا العمل بروتوكولا لتحديد البلازميدات المترافقة في البكتيريا. ولكي يعمل البروتوكول، تحتاج العلامات المستخدمة إلى التمييز بين سلالات المتبرعين والمتلقين، كما هو موضح في الضوابط في الوسيطين ألف وباء. يحتاجون أيضا إلى اختيار الخلايا التي تحمل البلازميد بشكل فعال. رد فعل التزاوج أمر بالغ الأهمية. في رد الفعل هذا ، يحتاج المتبرعون والمتلقون إلى إجراء اتصال طويل الأمد (من خلال pili) لحدوث الاقتران. أي شيء يمكن أن يعطل الاتصال من خلية إلى خلية ، مثل عدم كفاية وقت الحضانة أو هز أو تحريك الثقافة ، وبالتالي يقلل من كفاءة الاقتران. يعد اختيار المتلقي أمرا بالغ الأهمية أيضا ، حيث أن بعض سلالات المتلقي مقاومة للاقتران^35,36. يقترح LMB100 كمتلقي للاختيار ، لأنه قادر على أخذ البلازميدات من أنواع متعددة من عدم التوافق.

معدل الاقتران محدد لكل زوج كروموسوم مانح للبلازميد ومتلقي وحالة بيئية. تم العثور على اقتران بلازميدات معينة لتكون حساسة لعدد كبير من المتغيرات ، بما في ذلك مرحلة النمو ، وكثافة الخلية ، ونسبة المتبرع إلى المتلقي ، سواء تم إجراء الاقتران في الوسائط السائلة أو الصلبة ، والكربون ، والأكسجين ، والأملاح الصفراوية ، وتركيزات المعادن ، ووجود خلايا الثدييات ، ودرجة الحرارة ، ودرجة الحموضة ، ووقت التزاوج¹³،¹⁴^،¹⁵ . تعتمد دراسة هذه التفاعلات على الكشف الأولي عن البلازميد الاقتراني المراد دراسته بعمق. وبالتالي ، يمكن أيضا تعديل البروتوكول الموصوف هنا لاستكشاف تأثير المتغيرات التجريبية المختلفة ، على الرغم من أن هذا يأتي على حساب تقييد عدد المتبرعين الذين تم فحصهم. يمكنه أيضا تحديد البلازميدات القابلة للتعبئة في المضيفين الذين لديهم بلازميدات مساعدة (أي البلازميدات التي تمكن من الاقتران من خلال توفير وظائف مفقودة من البلازميدات القابلة للتعبئة في trans⁶).

يوصى بمعرفة تسلسل البلازميد الاقتراني (ولكن ليس من الضروري اكتشاف الاقتران ، كما نوقش أعلاه). عندما يكون المتبرعون سلبيين للاكتوز (ينتجون مستعمرات صفراء على أجار MacConkey) ، يمكن استخدام متلقي إيجابي اللاكتوز (ينتج مستعمرات وردية على أجار MacConkey) لتمييز المرافقات الحقيقية عن الخلايا المانحة القادرة على النمو على الوسائط لاختيار المرافقات. تم تصميم البروتوكول الموصوف هنا للكشف عن البلازميدات المترافقة من الأعضاء البيئيين والمتعايشين والممرضين من عائلة Enterobacteriaceae. ومع ذلك ، يمكن استخدامه مع أي نوع بكتيري مع متبرع مناسب ، ومتلقي ، ومضاد حيوي (مضادات حيوية) ، وعلامات لون. يتطلب تحديد هذه المكونات الحرجة في البكتيريا الأخرى دراسات منهجية باستخدام العديد من المتبرعين والمتلقين والعلامات (المضادات الحيوية والألوان). لم يتم اختبار هذا البروتوكول في البكتيريا إيجابية الجرام.

تم الإبلاغ عن العديد من المتغيرات للطريقة المعروضة هنا في الأدبيات ، التي تمت مراجعتها مؤخرا²⁰. يمكن أيضا الإشارة إلى النتيجة النوعية بطرق مختلفة (على سبيل المثال ، تردد الاقتران وتردد نقل الجينات) ، ويمكن استخدام الوحدات عديمة الأبعاد للإبلاغ عن كفاءة الاقتران (mL / CFU x h)²⁰.

يحل البروتوكول الموصوف هنا العديد من القيود التي لم يتم تناولها سابقا بواسطة الطرق الحالية¹⁶،¹⁸^،¹⁹^،²⁰. أولا ، تم تحديد المتلقي المناسب. ثانيا ، إن استخدام اثنين من المضادات الحيوية (ريفامبين وستربتومايسين) لاختيار ترانسكونوجينات حقيقية يقلل من احتمال أن يطور المتبرعون مقاومة لأحد المضادات الحيوية المستخدمة لاختيار المرافقات العابرة من خلال الطفرات التلقائية. يمكن أن تنتج المرافقات الكاذبة أيضا عن حماية المارة عن طريق التحلل المائي للمضاد الحيوي المستخدم لاختيار المرافقات بواسطة الإنزيمات (مثل بيتا لاكتاماز) التي تنتجها المتبرعة بكميات كبيرة. ثالثا ، يتم تضمين العديد من الضوابط التجريبية للتأكد من أن منتج التزاوج هو ترافق حقيقي (أي خلية متلقية أدرجت بثبات البلازميد المترافق للمتبرع). هنا ، قدمنا طريقتين مستقلتين لاختبار صحة المرافقات ، وهما علامة لونية في MacConkey agar ، واكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل للريبأيكون والجينات المقاومة للمضادات الحيوية للبلازميد المترافق في المتلقي. أيضا ، تم تصميم البروتوكول الموصوف هنا لعزل وتوصيف البلازميدات المترافقة من الأعضاء البيئيين والمتعايشين والممرضين في عائلة Enterobacteriaceae (Escherichia ، Klebsiella ، Enterobacter ، Citrobacter ، السالمونيلا ، الشيغيلة ، والأنواع الأخرى).

لفهم آليات الاقتران ، تم نمذجة الملاحظات التجريبية باستخدام المحاكاة الحاسوبية. تقدر هذه النماذج التنبؤية تواتر نقل البلازميد لكثافات نمو معينة للمتبرعين والمتلقين والمترافقنات. وجد نموذج يعرف باسم نموذج نقطة النهاية عتبات فوقها معدل نقل البلازميد في الثقافة السائلة ، وخلص إلى أن معدل النقل لا يتأثر بكثافة الخلية ، ونسبة المتبرع: المتلقي ، وزمن^{التزاوج 19}. تم استخدام التهجين الفلوري في الموقع (FISH) كطريقة بديلة للكشف عن البلازميد المترافق. يسمح FISH بتصور البلازميد باستخدام المجهر الفلوري من خلال تهجين مسبار الحمض النووي والحمض النووي المستهدف. وبالتالي ، يسمح FISH بالكشف البصري عن تدفقات البلازميد عبر مجموعات الخلايا^{المختلفة 37} ، على الرغم من أنه لا يتمتع بنفس مستوى الحساسية مثل الطريقة المعروضة هنا إذا تم الكشف عن الاقتران عن طريق الفحص البصري بدلا من الاختيار.

هناك حاجة هائلة لفهم بيولوجيا البلازميدات المترافقة التي تعمل على تشتيت الجينات المقاومة للمضادات الحيوية من خلال مكونات مختلفة من النظام البيئي (العيادة ، والزراعة ، والصرف الصحي ، والحياة البرية ، والحيوانات الأليفة ، والتربة ، والأنهار ، والبحيرات). باختصار، تسهل الظروف التجريبية المبسطة المقدمة في البروتوكولات الموصوفة هنا فحص المتبرعين على نطاق واسع، وبالتالي تمثل أداة رئيسية لدراسة نقل الجينات الأفقي الذي ينشأ في البلازميدات المترافقة من مجموعة متنوعة من المصادر. يمكن استخدامها للتحقيق في انتشار الجينات المقاومة للمضادات الحيوية أو غيرها من الجينات ذات الصلة سريريا في البلازميدات المترافقة من مصادر وبكتيريا متعددة. يمكن أيضا تكييفها لدراسة الاقتران في الجسم الحي (على سبيل المثال ، في أمعاء الفقاريات) ودراسة الظروف التي تعدل كفاءة الاقتران. وستضيف كل هذه الدراسات إلى حد كبير إلى فهم كيفية مساهمة تعبئة البلازميدات المترافقة المقاومة للأدوية المتعددة في انتشار مقاومة الأدوية المتعددة.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم LM-B و IMG و AT و IS من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة GM055246 الممنوحة ل LM-B. حصلت GC-C على زمالة UC MEXUS-CONACYT لما بعد الدكتوراه لمدة عامين متتاليين: AY 2017-18 و 2018-19. نشكر بشدة الطلاب Sage Chavez و Pepper St. Clair من برنامج التوجيه الذي ترعاه مؤسسة Genentech Foundation لشبكة الإلهام الأكاديمي (GAIN) لدعمهم الفني في التجارب.

Materials

1.5 mL tube racks	Thermo Fisher Scientific	22-313630	It can be replaced for another brand
2.0 mL Cryogenic vials	Corning	430659	It can be replaced for another brand
14 mL conical tubes	FALCON	149597	It can be replaced for another brand
14 mL tube racks	Thermo Fisher Scientific	8850	It can be replaced for another brand
1 kb DNA ladder	New England Biolabs	N0552G
250 mL sterile flasks	PYREX	5320	It can be replaced for another permanent marker brand
Acetic acid	Fisher Scientific	A38SI-212	It can be replaced for another brand
Agarose (molecular biology grade, multipurpose)	Fisher Scientific	BP160-500	It can be replaced for another brand
Carbenicillin	GOLD BIOTECHNOLOGY	C-103-50	It can be replaced for another brand
Disposable inoculating loops: 1 µL	Fisherbrand	22-363-595	It can be replaced for another brand
DNA gel loading dye 6x	New England Biolabs	B7024S	It can be replaced for another brand
EDTA	Fisher Scientific	BP119-500	It can be replaced for another brand
Electronic digital scale	Denver Instrument	APX-2001	It can be replaced for another brand
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL	Eppendorf	14-282-302	It can be replaced for another brand
Equipment for agarose gel electrophoresis	Fisher Scientific	FP300	It can be replaced for another brand
Ethanol-resistant markers	Sharpie	37001; 37002; 37003	It can be replaced for another brand
Gel documentation systems (UVP GelSolo)	Analytakjena	SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01	It can be replaced for another brand
Gloves	X-GEN	44-100M	Any nitrile gloves brand works
Ice bucket	Thermo Fisher Scientific	432128	It can be replaced for another brand
MacConkey agar	BD DIFCO	212123
Master Mix	BioLabs	M0496S	It can be replaced for another brand
Methanol	Fisher Scientific	A452-4	It can be replaced for another brand
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL	Fisherbrand	05-408-138	It can be replaced for another brand
Mueller Hinton agar	BD DIFCO	DF0479-17-3
Mueller Hinton broth	BD DIFCO	275730
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA	Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL	740588. 250
PCR tube racks	AXYGEN	R96PCRFSP	It can be replaced for another brand
PCR tubes (0.2 mL)	AXYGEN	PCR-02-C	It can be replaced for another brand
Rifampicin	Fisher Scientific	50-164-7517
Set of micropipettes that dispense between 1 – 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000)	RAININ	17008648; 17008650; 17008652; 17008653	Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand
Sodium chloride	Fisher Scientific	S671-3	It can be replaced for another brand
Spectrophotometer	Thermo Scientific	335905P	It can be replaced for another brand
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL	Eclipse	1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9	It can be replaced for another brand
Streptomycin	Fisher Scientific	BP910-50
SYBR Safe DNA gel stain	Thermo Fisher Scientific	S33102
Taq DNA Polymerase	BioLabs	M0273S
Thermal cycler C1000 Touch	Bio-Rad	1851196	It can be replaced for another brand
Tris	Fisher Scientific	BP153-500	It can be replaced for another brand

References

Lederberg, J., Tatum, E. Gene recombination in Escherichia coli. Nature. 158 (4016), 558 (1946).
de la Cruz, F., Frost, L. S., Meyer, R. J., Zechner, E. L. Conjugative DNA metabolism in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (1), 18-40 (2010).
Grohmann, E., Muth, G., Espinosa, M. Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (2), 277-301 (2003).
Koraimann, G., Wagner, M. A. Social behavior and decision making in bacterial conjugation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 54 (2014).
Dziewit, L., et al. Diversity and role of plasmids in adaptation of bacteria inhabiting the Lubin copper mine in Poland, an environment rich in heavy metals. Frontiers in Microbiology. 6, 152 (2015).
Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
Balbuena-Alonso, M. G., et al. Genomic analysis of plasmid content in food isolates of E. coli strongly supports its role as a reservoir for the horizontal transfer of virulence and antibiotic resistance genes. Plasmid. 123-124, 102650 (2022).
San Millan, A., MacLean, R. C. Fitness costs of plasmids: A limit to plasmid transmission. Microbiol Spectrum. 5 (5), (2017).
Coluzzi, C., Garcillán-Barcia, M. P., de la Cruz, F., Rocha, E. P. C. Evolution of plasmid mobility: Origin and fate of conjugative and nonconjugative plasmids. Molecular Biology and Evolution. 39 (6), 1-23 (2022).
Bevan, E. R., et al. Molecular characterization of plasmids encoding blaCTX-M from faecal Escherichia coli in travellers returning to the UK from South Asia. The Journal of Hospital Infection. 114, 134-143 (2021).
Minja, C. A., Shirima, G., Mshana, S. E. Conjugative plasmids disseminating CTX-M-15 among human, animals and the environment in Mwanza Tanzania: a need to intensify one health approach. Antibiotics. 10 (7), 836 (2021).
Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. International Journal of Medical Microbiology. 303 (6-7), 298-304 (2013).
Sengupta, M., Austin, S. Prevalence and significance of plasmid maintenance functions in the virulence plasmids of pathogenic bacteria. Infection and Immunity. 79 (7), 2502-2509 (2011).
Alderliesten, J. B., et al. Effect of donor-recipient relatedness on the plasmid conjugation frequency: a meta-analysis. BMC Microbiology. 20 (1), 135 (2020).
Neil, K., Allard, N., Rodrigue, S. Molecular mechanisms influencing bacterial conjugation in the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 12, 673260 (2021).
Liu, G., Bogaj, K., Bortolaia, V., Olsen, J. E., Thomsen, L. E. Antibiotic-induced, increased conjugative transfer is common to diverse naturally occurring ESBL plasmids in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 2119 (2019).
Suchman, E. Polymerase chain reaction protocol. American Society for Microbiology. , 1-14 (2011).
Watanabe, T. Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria. Bacteriological Reviews. 27 (1), 87-115 (1963).
Simonsen, L., Gordon, D. M., Stewart, F. M., Levin, B. R. Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method. Journal of General Microbiology. 136 (11), 2319-2325 (1990).
Huisman, J. S., et al. Estimating plasmid conjugation rates: A new computational tool and a critical comparison of methods. Plasmid. 121, 102627 (2022).
Jung, B., Hoilat, G. J. MacConkey medium. StatPearls. , (2022).
. NucleoSpin Plasmid DNA purification Available from: https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf (2022)
Jiang, X., et al. Detection of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9), 2990-2995 (2006).
Stapleton, P. D., Shannon, K. P., French, G. L. Carbapenem resistance in Escherichia coli associated with plasmid-determined CMY-4 beta-lactamase production and loss of an outer membrane protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (5), 1206-1210 (1999).
Ben Yahia, H., et al. Detection of CTX-M-15 harboring Escherichia coli isolated from wild birds in Tunisia. BMC Microbiology. 18 (1), 26 (2018).
Madsen, L., Aarestrup, F. M., Olsen, J. E. Characterisation of streptomycin resistance determinants in Danish isolates of Salmonella Typhimurium. Veterinary Microbiology. 75 (1), 73-82 (2000).
Perreten, V., Boerlin, P. A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (3), 1169-1172 (2003).
Guardabassi, L., Dijkshoorn, L., Collard, J. M., Olsen, J. E., Dalsgaard, A. Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains. Journal of Medical Microbiology. 49 (10), 929-936 (2000).
Carattoli, A., et al. Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. Journal of Microbiological Methods. 63 (3), 219-228 (2005).
Green, M. R., Sambrook, J. Agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor protocols. 2019 (1), (2019).
Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutation Research. 439 (1), 37-47 (1999).
Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators. Analytical Biochemistry. 268 (2), 278-288 (1999).
Oatey, P. Imaging fluorescently stained DNA with CCD technology How to increase sensitivity and reduce integration times. Biotechniques. 42 (3), 376-377 (2007).
Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Conjugative plasmids: vessels of the communal gene pool. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 364 (1527), 2275-2289 (2009).
Du, L., Liu, R. H., Ying, L., Zhao, G. R. An efficient intergeneric conjugation of DNA from Escherichia coli to mycelia of the lincomycin-producer Streptomyces lincolnensis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 4797-4806 (2012).
Kirk, J. A., Fagan, R. P. Heat shock increases conjugation efficiency in Clostridium difficile. Anaerobe. 42, 1-5 (2016).
Esteves, G. M., Pereira, J. A., Azevedo, N. F., Azevedo, A. S., Mendes, L. Friends with benefits: An inside look of periodontal microbes’ interactions using fluorescence in situ hybridization-Scoping review. Microorganisms. 9 (7), 1504 (2021).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Mota-Bravo, L., Camps, M., Muñoz-Gutiérrez, I., Tatarenkov, A., Warner, C., Suarez, I., Cortés-Cortés, G. Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli. J. Vis. Exp. (193), e64523, doi:10.3791/64523 (2023).

Automatically Generated