La conjugaison intervient dans le transfert horizontal de gènes en mobilisant l’ADN plasmidique à travers deux cellules différentes, facilitant ainsi la propagation de gènes bénéfiques. Ce travail décrit une méthode largement utilisée pour la détection efficace du transfert plasmidique conjugatif, basée sur l’utilisation de marqueurs différentiels dans le plasmide conjugatif, le donneur et le receveur pour détecter la transconjugaison.
La conjugaison représente l’un des principaux mécanismes facilitant le transfert horizontal de gènes chez les bactéries à Gram négatif. Ce travail décrit des méthodes pour l’étude de la mobilisation des plasmides conjugatifs naturels, en utilisant deux plasmides naturels comme exemple. Ces protocoles reposent sur la présence différentielle de marqueurs sélectionnables dans le plasmide donneur, receveur et conjugatif. Plus précisément, les méthodes décrites comprennent 1) l’identification des plasmides conjugatifs naturels, 2) la quantification des taux de conjugaison en culture solide et 3) la détection diagnostique des gènes de résistance aux antibiotiques et des types plasmidiques réplicons chez les receveurs transconjugués par réaction en chaîne de la polymérase (PCR). Les protocoles décrits ici ont été développés dans le contexte de l’étude de l’écologie évolutive du transfert horizontal de gènes, afin de dépister la présence de plasmides conjugatifs porteurs de gènes de résistance aux antibiotiques dans les bactéries présentes dans l’environnement. Le transfert efficace de plasmides conjugatifs observé dans ces expériences en culture met en évidence la pertinence biologique de la conjugaison en tant que mécanisme favorisant le transfert horizontal de gènes en général et la propagation de la résistance aux antibiotiques en particulier.
En 1946, Lederberg et Tatum1 ont décrit un processus sexuel chez Escherichia coli K-12 qui est maintenant connu sous le nom de conjugaison. La conjugaison bactérienne est le processus par lequel une cellule bactérienne (le donneur) transfère unilatéralement du matériel génétique à une autre cellule (le receveur) par contact direct de cellule à cellule. La conjugaison est largement distribuée dans les bactéries2,3, bien que la fraction de cellules donneuses exprimant la machinerie de conjugaison soit généralement très petite4.
Les plasmides sont des éléments d’ADN extrachromosomiques qui se répliquent de manière autonome. Outre les gènes impliqués dans la réplication et la maintenance des plasmides, les plasmides transportent fréquemment une cargaison de gènes impliqués dans l’adaptation aux défis environnementaux, tels que les métaux lourds ou l’exposition aux antibiotiques5. Les plasmides conjugatifs sont une classe de plasmides avec un ensemble de gènes spécialisés qui permettent leur transfert aux cellules réceptrices et soutiennent leur persistance après le transfert6. La taille des plasmides conjugués varie de 21,8 kb à 1,35 Mb chez les bactéries du phylum Pseudomonadota (synonyme de Proteobacteria), avec une médiane d’environ 100 kb 5,7. Ils ont aussi généralement un faible nombre de copies, peut-être pour maintenir la charge métabolique sur l’hôte faible 8,9.
L’appareil conjugatif typique se compose de quatre composants: une origine de transfert (oriT), une relaxase, une protéine de couplage de type IV et un système de sécrétion de type IV (une structure en forme de tube appelée pilus qui permet aux donneurs de contacter les receveurs)6. Seule une très petite fraction des cellules portant des plasmides conjugatifs exprime la machinerie de conjugaison4, mais si les plasmides offrent un avantage de fitness, les transconjuguants peuvent rapidement se développer dans la population. Entre 35 % et plus de 80 % des isolats d’E. coli prélevés dans différents habitats ont des plasmides conjugués avec des gènes qui confèrent une résistance à au moins un antibiotique10,11; Par conséquent, le transfert horizontal de gènes médié par des plasmides conjugatifs est un mécanisme majeur de la propagation mondiale des gènes de résistance aux antibiotiques12.
Les expériences d’accouplement menées en culture en laboratoire ont montré que la fréquence de conjugaison est affectée par de multiples facteurs, notamment la nature des cellules receveuses, la phase de croissance, la densité cellulaire, le rapport donneur-receveur, si la conjugaison est effectuée dans des milieux liquides ou solides, le carbone, l’oxygène, les sels biliaires, les concentrations de métaux, la présence de cellules de mammifères, la température, le pH et le temps d’accouplement13,14, 15.
Ce travail décrit des protocoles pour détecter la présence de plasmides conjugatifs dans une souche hôte donnée, pour quantifier les taux de conjugaison en culture solide et pour vérifier leur transfert aux cellules receveuses. Ces protocoles peuvent être utilisés comme première étape pour l’identification de plasmides conjugatifs naturels adaptés à la recherche. Ils utilisent un nombre minimum d’étapes simplifiées car ils sont conçus pour dépister la présence de plasmides conjugatifs dans les bactéries obtenues à partir de sources multiples (environnementales, commensales et pathogènes) à grande échelle (des dizaines à des centaines de donneurs).
De plus, des tests permettant de détecter si la mobilisation d’un plasmide conjugatif donné est indépendante de l’antibiotique utilisé pour la détection (c.-à-d. la pertinence du gène de résistance aux antibiotiques en cours de sélection) et de comparer les taux de conjugaison de deux plasmides conjugatifs trouvés dans différents isolats environnementaux sont présentés.
Sur la base de la composition génétique des plasmides conjugatifs pertinents (plasmid replicon et constitution de gènes de résistance aux antibiotiques), chaque étape du protocole peut être modifiée pour étudier l’impact d’une variété de facteurs susceptibles d’affecter le taux de conjugaison.
Plan expérimental général :
Les composants essentiels nécessaires à la mise en place d’une expérience d’accouplement sont les cellules du donneur, une souche receveuse et des milieux solides pour sélectionner les donneurs (antibiotique A), les receveurs (antibiotique B) et les transconjuguants (antibiotiques A et B). Les transconjuguants sont des cellules receveuses qui maintiennent de manière stable le plasmide conjugatif du donneur.
Les cellules du donneur sont résistantes à un antibiotique (antibiotique A) et sont sensibles au ou aux marqueurs utilisés pour sélectionner les cellules receveuses (antibiotique B). Il n’est pas nécessaire de connaître a priori l’emplacement génomique du gène de résistance aux antibiotiques (c.-à-d. s’il est situé dans le chromosome ou dans un plasmide de la cellule du donneur), car la mobilisation des marqueurs de résistance aux antibiotiques chez le receveur (après un contact direct donneur-receveur) implique que les marqueurs fournis par le donneur se trouvaient dans un plasmide.
Une souche receveuse (connue pour prendre des plasmides conjugatifs) doit avoir un marqueur sélectionnable stable qui n’est pas présent chez le donneur; Ce marqueur sélectionnable est généralement résistant à un antibiotique ou biocide situé dans le chromosome. Le choix du receveur à utiliser dans les expériences d’accouplement est critique, car certaines souches d’E. coli varient dans leur capacité à prendre des plasmides conjugatifs16.
Une fois ces composants établis, toute colonie qui se développe sur un milieu contenant à la fois des antibiotiques (A et B) après un contact entre donneurs et receveurs est un transconjuguant putatif (Figure 1). Cela suppose que les donneurs peuvent se développer dans des milieux avec l’antibiotique A mais ne peuvent pas se développer dans les milieux avec l’antibiotique B, et que les receveurs sont capables de se développer dans les milieux avec l’antibiotique B, mais pas avec l’antibiotique A. La transconjugaison peut être confirmée à l’aide de deux tests diagnostiques. Le premier test consiste en la détection (par amplification par amplification par réaction en chaîne de la polymérase [PCR] de gènes, ou d’autres méthodes) de gènes trouvés dans le plasmide conjugatif dans les colonies transconjuguantes. Le deuxième test implique l’utilisation de marqueurs de couleur différentiels de colonies basés sur le métabolisme du lactose. La couleur différentielle de la colonie est révélée par l’utilisation de la gélose MacConkey; Le lactose contenu dans la gélose peut être utilisé comme source de fermentation par les microorganismes fermenteurs de lactose (LAC+). Ces micro-organismes produisent des acides organiques, en particulier de l’acide lactique, qui abaissent le pH. Le rouge neutre est un indicateur de pH inclus dans le milieu qui passe du blanc cassé au rouge vif/rose lorsque le pH descend en dessous de 6,817. Ainsi, les souches d’E. coli à lactose positif produisent de plus grandes colonies roses sur la gélose MacConkey, tandis que les souches lactose négatives produisent des colonies jaune pâle et des colonies plus petites sur la gélose MacConkey.
Figure 1 : Plan expérimental utilisé pour détecter la présence de plasmides conjugatifs dans les souches de donneurs. Dans cet exemple, le donneur est porteur d’un plasmide conjugatif avec un gène de résistance aux antibiotiques qui lui confère une résistance à l’antibiotique A, mais il est sensible à l’antibiotique B. Inversement, le receveur a un déterminant de résistance chromosomique qui confère une protection contre l’antibiotique B, mais il est sensible à l’antibiotique A. Les transconjuguants sont résistants aux deux antibiotiques (A et B), parce qu’ils ont le plasmide conjugatif du donneur qui confère une résistance à l’antibiotique A et le chromosome du receveur qui confère une protection contre l’antibiotique B. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Le taux de conjugaison d’un couple donneur-receveur (dans des conditions expérimentales données) peut être calculé en divisant le nombre de transconjuguants par le nombre de donneurs ou par le nombre de receveurs; Le premier taux indique la fraction de cellules donneuses présentant une expression fonctionnelle de la machinerie de conjugaison par le donneur16,18, tandis que le second taux indique la capacité du receveur à prendre des plasmides conjugatifs 19,20. Dans cette étude, sauf indication contraire, le taux de conjugaison représente la fraction des cellules receveuses qui deviennent transconjuguantes (c.-à-d. le taux par receveur).
Ici, deux expériences d’accouplement indépendantes sont rapportées, impliquant un receveur d’E . coli et deux donneurs d’E. coli. En outre, différents antibiotiques ont été utilisés pour sélectionner des transconjuguants pour l’un des donneurs afin de confirmer qu’un seul plasmide multirésistant peut être sélectionné avec l’un des gènes de résistance aux antibiotiques trouvés dans le plasmide conjugatif.
Les souches donneuses et receveuses utilisées dans ce travail ont été entièrement séquencées pour comprendre toutes les composantes de ce système expérimental; Cependant, ces protocoles ont été conçus pour dépister la présence de plasmides conjugatifs chez des hôtes de séquence inconnue, et peuvent également être utilisés dans ce contexte expérimental; Cependant, dans ce cas, les gènes pertinents sont séquencés en premier.
Les souches donneuses et receveuses utilisées dans le protocole sont les suivantes :
Donateur 1. E. coli SW4955 a été collecté dans un lac de Baton Rouge (LA, USA). Il a un plasmide conjugatif de 134 797 pb (p134797) avec des réponses IncFIC(FII) et IncFIB (AP001918). Ce plasmide conjugatif possède des gènes qui confèrent une résistance aux céphalosporines de troisième génération (blaCTX-M-55), aux aminosides (aac(3)-IIa et aadA1), aux phénicols (catA2), aux tétracyclines (tet(A)), au triméthoprime (dfrA14) et aux sulfamides (sul3). Pour une carte complète de p134797, veuillez consulter la figure 2A. E. coli SW4955 est positif au lactose, produisant des colonies roses sur gélose MacConkey.
Donateur 2. E. coli SW7037 a été recueilli dans le lac Érié (Ottawa County, OH, USA). Il porte un plasmide conjugatif de 101 718 pb (p101718) avec un réplicon IncI1-I(Alpha). Ce plasmide conjugatif possède un gène qui confère une résistance aux bêta-lactamines (blaCMJ-2). Pour une carte complète de p101718, veuillez consulter la figure 2B. E. coli SW7037 est également positif au lactose, produisant des colonies roses sur gélose MacConkey.
Figure 2 : Carte génétique des plasmides conjugatifs utilisés dans cette étude. (A) Plasmide p134797, le plasmide conjugatif trouvé dans la souche SW4955 d’E. coli. (B) Plasmide p101718, le plasmide conjugatif trouvé dans la souche SW7037 d’E. coli. Les gènes de résistance aux antibiotiques sont surlignés en bleu et les gènes appartenant à l’appareil conjugatif sont surlignés en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
destinataire. E. coli LMB100 est utilisé comme destinataire. Il s’agit d’une souche sans plasmide résistante à la rifampicine (100 mg/L) et à la streptomycine (100 mg/L). Avoir une résistance à deux antibiotiques réduit la possibilité de mutations de résistance chez le donneur qui interféreraient avec l’interprétation des résultats. De plus, E. coli LMB100 est lactose-négatif et peut être distingué des deux souches donneuses parce qu’il produit des colonies jaune pâle et de petites colonies (par opposition aux colonies roses plus grandes) sur la gélose MacConkey.
Lorsque le donneur est lactose-négatif, nous recommandons d’utiliser un receveur lactose-positif (par exemple, E. coli J53). Les souches LMB100 et J53 sont disponibles pour d’autres laboratoires. Veuillez envoyer une demande au Dr Gerardo Cortés-Cortés avec une adresse et un numéro FedEx.
Le support solide nécessaire pour sélectionner et compter les donneurs, les receveurs et les transconjuguants est la gélose MacConkey dans des boîtes de Petri de 100 mm de diamètre. L’ajout des antibiotiques suivants est nécessaire : (i) Milieu A : carbénicilline (100 mg/L) pour compter les donneurs et s’assurer que les receveurs ne peuvent pas se développer avec cet antibiotique. (ii) Milieu B : rifampicine (100 mg/L) + streptomycine (100 mg/L) pour compter les receveurs et s’assurer que les donneurs ne peuvent pas cultiver dans ces deux antibiotiques. (iii) Milieux AB : carbénicilline (100 mg/L) + rifampicine (100 mg/L) + streptomycine (100 mg/L) pour obtenir et compter les transconjugants. (iv) Milieu C : pas d’antibiotiques pour strier tous les isolats étudiés.
Les taux de conjugaison des plasmides conjugatifs d’E. coli SW4955 et E. coli SW7037 à E. coli LMB100 sont comparés. De plus, dans le cas du plasmide conjugatif p134797 (souche SW4955), l’antibiotique carbénicilline (100 mg/L) est remplacé par la gentamicine (2 mg/L), le chloramphénicol (25 mg/L), la tétracycline (10 mg/L), le triméthoprime (20 mg/L) ou le sulfaméthoxazole (100 mg/L) dans des expériences ultérieures visant à déterminer si le marqueur de résistance aux antibiotiques utilisé pour la sélection a un impact sur les résultats.
Les plasmides conjugatifs donnent accès à un pool commun de gènes dans un environnement particulier par recombinaison et transfert horizontal de gènes34. Ainsi, les plasmides conjugatifs sont des entités évolutives capables d’acquérir et de conférer des fonctions qui permettent aux bactéries de s’adapter à de multiples conditions (y compris la résistance aux antibiotiques, la résistance aux métaux, l’acquisition de métaux, la formation de biofilms et les gènes pathogènes, entre autres) dans une échelle temporelle d’heures.
Ce travail présente un protocole pour l’identification des plasmides conjugatifs chez les bactéries. Pour que le protocole fonctionne, les marqueurs utilisés doivent différencier les souches donneuses et receveuses, comme le montrent les contrôles dans les milieux A et B. Ils doivent également sélectionner efficacement les cellules porteuses du plasmide. La réaction d’accouplement est critique. Dans cette réaction, les donneurs et les receveurs doivent établir un contact prolongé (par pili) pour que la conjugaison se produise. Tout ce qui peut perturber le contact de cellule à cellule, comme un temps d’incubation insuffisant ou secouer ou agiter la culture, diminue ainsi l’efficacité de la conjugaison. Le choix du receveur est également critique, car certaines souches de receveurs sont réfractaires à la conjugaison35,36. LMB100 est proposé comme destinataire de choix, car il est capable de prendre des plasmides de plusieurs types d’incompatibilité.
Le taux de conjugaison est spécifique pour chaque paire plasmido-donneur, receveur et condition environnementale. La conjugaison de plasmides spécifiques s’est avérée sensible à un grand nombre de variables, y compris la phase de croissance, la densité cellulaire, le rapport donneur-receveur, si la conjugaison est effectuée dans un milieu liquide ou solide, le carbone, l’oxygène, les sels biliaires, les concentrations de métaux, la présence de cellules de mammifères, la température, le pH et le temps d’accouplement13,14,15 . L’étude de ces interactions dépend de la détection initiale d’un plasmide conjugatif à étudier en profondeur. Ainsi, le protocole décrit ici peut également être modifié pour explorer l’impact de différentes variables expérimentales, bien que cela se fasse au prix d’une restriction du nombre de donneurs sélectionnés. Il peut également identifier les plasmides mobilisables chez les hôtes qui ont des plasmides auxiliaires (c’est-à-dire les plasmides qui permettent la conjugaison en fournissant des fonctions manquantes aux plasmides mobilisables dans trans 6).
Connaître la séquence du plasmide conjugatif est recommandé (mais pas nécessaire pour détecter la conjugaison, comme discuté ci-dessus). Lorsque les donneurs sont lactose-négatifs (produisant des colonies jaunes sur gélose MacConkey), un receveur positif au lactose (produisant des colonies roses sur gélose MacConkey) peut être utilisé pour distinguer les vrais transconjuguants des cellules de donneur qui sont capables de se développer sur le milieu pour sélectionner des transconjuguants. Le protocole décrit ici est conçu pour détecter les plasmides conjugatifs des membres environnementaux, commenaux et pathogènes de la famille des Enterobacteriaceae; Cependant, il peut être utilisé avec n’importe quelle espèce bactérienne avec un donneur, un receveur, un antibiotique ou des marqueurs de couleur appropriés. L’identification de ces composants critiques dans d’autres bactéries nécessite des études systématiques utilisant plusieurs donneurs, receveurs et marqueurs (antibiotiques et couleurs). Ce protocole n’a pas été testé chez les bactéries à Gram positif.
Plusieurs variantes de la méthode présentée ici ont été rapportées dans la littérature, récemment revue20. Le résultat qualitatif peut également être mentionné de différentes façons (p. ex. fréquence des exconjuguants et fréquence de transfert de gènes), et les unités sans dimension peuvent être utilisées pour rendre compte de l’efficacité de la conjugaison (mL/UFC x h)20.
Le protocole décrit ici résout plusieurs limitations qui n’étaient pas traitées auparavant par les méthodes existantes16,18,19,20. Tout d’abord, un destinataire approprié a été identifié. Deuxièmement, l’utilisation de deux antibiotiques (rifampicine et streptomycine) pour sélectionner les vrais transconjuguants minimise la possibilité que les donneurs développent une résistance à l’un des antibiotiques utilisés pour sélectionner les transconjuguants par mutagénèse spontanée. Les faux transconjuguants peuvent également résulter de la protection des témoins par hydrolyse de l’antibiotique utilisé pour sélectionner les transconjuguants par des enzymes (p. ex. bêta-lactamases) produites en grande quantité par le donneur. Troisièmement, plusieurs témoins expérimentaux sont inclus pour s’assurer que le produit de l’accouplement est un véritable transconjuguant (c.-à-d. une cellule receveuse qui a incorporé de façon stable le plasmide conjugatif du donneur). Ici, nous avons présenté deux méthodes indépendantes pour tester l’authenticité des transconjuguants, à savoir un marqueur colorimétrique dans la gélose MacConkey et la détection par PCR des réplicons et des gènes de résistance aux antibiotiques du plasmide conjugatif chez le receveur. En outre, le protocole décrit ici est conçu pour isoler et caractériser les plasmides conjugatifs des membres environnementaux, commenaux et pathogènes de la famille des Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella et d’autres espèces).
Pour comprendre la mécanique de la conjugaison, des observations expérimentales ont été modélisées à l’aide de simulations informatiques. Ces modèles prédictifs estiment la fréquence du transfert plasmidique pour des densités de croissance données des donneurs, des receveurs et des transconjuguants. Un modèle connu sous le nom de modèle de point final a trouvé des seuils au-dessus desquels le taux de transfert plasmidique en culture liquide et a conclu que le taux de transfert n’est pas affecté par la densité cellulaire, le rapport donneur/receveur et le temps d’accouplement19. L’hybridation in situ par fluorescence (FISH) a été utilisée comme méthode alternative de détection des plasmides transconjuguants. FISH permet la visualisation plasmidique à l’aide de la microscopie à fluorescence grâce à l’hybridation d’une sonde à ADN et d’un ADN cible. Ainsi, FISH permet la détection visuelle des écoulements plasmidiques à travers différentes populations cellulaires37, bien qu’il n’ait pas le même niveau de sensibilité que la méthode présentée ici si les transconjuguants sont détectés par criblage visuel par opposition à la sélection.
Il y a un énorme besoin de comprendre la biologie des plasmides conjugatifs qui dispersent les gènes de résistance aux antibiotiques à travers différentes composantes de l’écosystème (clinique, agriculture, eaux usées, faune, animaux domestiques, sols, rivières et lacs). En somme, les conditions expérimentales simplifiées présentées dans les protocoles décrits ici facilitent le criblage des donneurs à grande échelle, et représentent ainsi un outil clé pour l’étude du transfert horizontal de gènes provenant de plasmides conjugatifs provenant de diverses sources. Ils peuvent être utilisés pour étudier la prévalence de gènes de résistance aux antibiotiques ou d’autres gènes cliniquement pertinents dans les plasmides conjugatifs provenant de sources multiples et de bactéries. Ils peuvent également être adaptés pour l’étude de la conjugaison in vivo (par exemple, dans l’intestin des vertébrés) et pour étudier les conditions qui modulent l’efficacité de la conjugaison. Toutes ces études permettront de mieux comprendre comment la mobilisation des plasmides conjugatifs multirésistants contribue à la propagation de la multirésistance.
The authors have nothing to disclose.
LM-B, IMG, AT et IS ont été soutenus par la subvention GM055246 des NIH accordée à LM-B. GC-C a reçu la bourse postdoctorale UC MEXUS-CONACYT pour deux années consécutives: AY 2017-18 et 2018-19. Nous remercions vivement les étudiants Sage Chavez et Pepper St. Clair du programme de mentorat Academic Inspiration Network (GAIN) parrainé par la Fondation Genentech pour leur soutien technique dans les expériences.
1.5 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 22-313630 | It can be replaced for another brand |
2.0 mL Cryogenic vials | Corning | 430659 | It can be replaced for another brand |
14 mL conical tubes | FALCON | 149597 | It can be replaced for another brand |
14 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 8850 | It can be replaced for another brand |
1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N0552G | |
250 mL sterile flasks | PYREX | 5320 | It can be replaced for another permanent marker brand |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38SI-212 | It can be replaced for another brand |
Agarose (molecular biology grade, multipurpose) | Fisher Scientific | BP160-500 | It can be replaced for another brand |
Carbenicillin | GOLD BIOTECHNOLOGY | C-103-50 | It can be replaced for another brand |
Disposable inoculating loops: 1 µL | Fisherbrand | 22-363-595 | It can be replaced for another brand |
DNA gel loading dye 6x | New England Biolabs | B7024S | It can be replaced for another brand |
EDTA | Fisher Scientific | BP119-500 | It can be replaced for another brand |
Electronic digital scale | Denver Instrument | APX-2001 | It can be replaced for another brand |
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL | Eppendorf | 14-282-302 | It can be replaced for another brand |
Equipment for agarose gel electrophoresis | Fisher Scientific | FP300 | It can be replaced for another brand |
Ethanol-resistant markers | Sharpie | 37001; 37002; 37003 | It can be replaced for another brand |
Gel documentation systems (UVP GelSolo) | Analytakjena | SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 | It can be replaced for another brand |
Gloves | X-GEN | 44-100M | Any nitrile gloves brand works |
Ice bucket | Thermo Fisher Scientific | 432128 | It can be replaced for another brand |
MacConkey agar | BD DIFCO | 212123 | |
Master Mix | BioLabs | M0496S | It can be replaced for another brand |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | It can be replaced for another brand |
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL | Fisherbrand | 05-408-138 | It can be replaced for another brand |
Mueller Hinton agar | BD DIFCO | DF0479-17-3 | |
Mueller Hinton broth | BD DIFCO | 275730 | |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL | 740588. 250 | |
PCR tube racks | AXYGEN | R96PCRFSP | It can be replaced for another brand |
PCR tubes (0.2 mL) | AXYGEN | PCR-02-C | It can be replaced for another brand |
Rifampicin | Fisher Scientific | 50-164-7517 | |
Set of micropipettes that dispense between 1 – 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) | RAININ | 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 | Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-3 | It can be replaced for another brand |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | 335905P | It can be replaced for another brand |
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL | Eclipse | 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 | It can be replaced for another brand |
Streptomycin | Fisher Scientific | BP910-50 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
Taq DNA Polymerase | BioLabs | M0273S | |
Thermal cycler C1000 Touch | Bio-Rad | 1851196 | It can be replaced for another brand |
Tris | Fisher Scientific | BP153-500 | It can be replaced for another brand |