Rilevazione del trasferimento genico orizzontale mediato da plasmidi coniugativi naturali in E. coli
Summary
La coniugazione media il trasferimento genico orizzontale mobilitando il DNA plasmidico attraverso due cellule diverse, facilitando la diffusione di geni benefici. Questo lavoro descrive un metodo ampiamente utilizzato per la rilevazione efficiente del trasferimento plasmidico coniugativo, basato sull’uso di marcatori differenziali nel plasmide coniugativo, nel donatore e nel ricevente per rilevare la transconiugazione.
Abstract
La coniugazione rappresenta uno dei principali meccanismi che facilitano il trasferimento genico orizzontale nei batteri Gram-negativi. Questo lavoro descrive i metodi per lo studio della mobilizzazione dei plasmidi coniugativi presenti in natura, usando due plasmidi presenti in natura come esempio. Questi protocolli si basano sulla presenza differenziale di marcatori selezionabili nel plasmide donatore, ricevente e coniugativo. In particolare, i metodi descritti includono 1) l’identificazione di plasmidi coniugativi naturali, 2) la quantificazione dei tassi di coniugazione in colture solide e 3) la rilevazione diagnostica dei geni di resistenza agli antibiotici e dei tipi di replicon plasmidico nei riceventi transconiuganti mediante reazione a catena della polimerasi (PCR). I protocolli qui descritti sono stati sviluppati nel contesto dello studio dell’ecologia evolutiva del trasferimento genico orizzontale, per lo screening della presenza di plasmidi coniugativi portatori di geni di resistenza agli antibiotici nei batteri presenti nell’ambiente. L’efficiente trasferimento di plasmidi coniugativi osservato in questi esperimenti in coltura evidenzia la rilevanza biologica della coniugazione come meccanismo che promuove il trasferimento genico orizzontale in generale e la diffusione della resistenza agli antibiotici in particolare.
Introduction
Nel 1946, Lederberg e Tatum1 descrissero un processo sessuale in Escherichia coli K-12 che ora è noto come coniugazione. La coniugazione batterica è il processo mediante il quale una cellula batterica (il donatore) trasferisce materiale genetico unidirezionale ad un’altra cellula (il ricevente) mediante contatto diretto cellula-cellula. La coniugazione è ampiamente distribuita nei batteri2,3, sebbene la frazione di cellule donatrici che esprimono il meccanismo di coniugazione sia tipicamente molto piccola4.
I plasmidi sono elementi del DNA extracromosomico a replicazione autonoma. Oltre ai geni coinvolti nella replicazione e nel mantenimento dei plasmidi, i plasmidi trasportano spesso un carico di geni coinvolti nell’adattamento alle sfide ambientali, come i metalli pesanti o l’esposizione agli antibiotici5. I plasmidi coniugativi sono una classe di plasmidi con un insieme di geni specializzati che consentono il loro trasferimento alle cellule riceventi e supportano la loro persistenza dopo il trasferimento6. I plasmidi coniugativi variano in dimensioni da 21,8 kb a 1,35 Mb nei batteri nel phylum Pseudomonadota (sinonimo di Proteobacteria), con la mediana intorno a 100 kb 5,7. Inoltre hanno generalmente un basso numero di copie, probabilmente per mantenere basso il carico metabolico sull’ospite 8,9.
Il tipico apparato coniugativo è costituito da quattro componenti: un’origine di trasferimento (oriT), una relaxasi, una proteina di accoppiamento di tipo IV e un sistema di secrezione di tipo IV (una struttura simile a un tubo chiamata pilus che consente ai donatori di contattare i riceventi)6. Solo una frazione molto piccola di cellule portatrici di plasmidi coniugativi esprime il meccanismo di coniugazione4, ma se i plasmidi forniscono un vantaggio di fitness, i transconiuganti possono espandersi rapidamente nella popolazione. Tra il 35% e oltre l’80% degli isolati di E. coli raccolti da habitat diversi hanno plasmidi coniugativi con geni che conferiscono resistenza ad almeno un antibiotico10,11; Pertanto, il trasferimento genico orizzontale mediato dai plasmidi coniugativi è un meccanismo importante che guida la diffusione globale dei geni di resistenza agli antibiotici12.
Gli esperimenti di accoppiamento condotti in coltura di laboratorio hanno dimostrato che la frequenza di coniugazione è influenzata da molteplici fattori, tra cui la natura delle cellule riceventi, la fase di crescita, la densità cellulare, il rapporto donatore-ricevente, se la coniugazione è condotta in mezzi liquidi o solidi, carbonio, ossigeno, sali biliari, concentrazioni di metalli, presenza di cellule di mammifero, temperatura, pH e tempo di accoppiamento13,14, 15.
Questo lavoro descrive protocolli per rilevare la presenza di plasmidi coniugativi in un dato ceppo ospite, per quantificare i tassi di coniugazione in coltura solida e per ricontrollare il loro trasferimento alle cellule riceventi. Questi protocolli possono essere utilizzati come primo passo per l’identificazione di plasmidi coniugativi naturali adatti alla ricerca. Usano un numero minimo di passaggi semplificati perché sono progettati per schermare la presenza di plasmidi coniugativi in batteri ottenuti da più fonti (ambientali, commensali e patogene) su larga scala (da decine a centinaia di donatori).
Inoltre, vengono mostrati test per rilevare se la mobilizzazione di un dato plasmide coniugativo è indipendente dall’antibiotico utilizzato per il rilevamento (cioè la rilevanza del gene di resistenza agli antibiotici in selezione) e per confrontare i tassi di coniugazione di due plasmidi coniugativi trovati in diversi isolati ambientali.
Sulla base della composizione genetica dei plasmidi coniugativi rilevanti (replicon plasmidico e composizione genica della resistenza agli antibiotici), ogni fase del protocollo può essere modificata per studiare l’impatto di una varietà di fattori che possono influenzare il tasso di coniugazione.
Disegno sperimentale generale:
I componenti essenziali necessari per impostare un esperimento di accoppiamento sono cellule donatrici, un ceppo ricevente e terreni solidi per selezionare donatori (antibiotico A), riceventi (antibiotico B) e transconiuganti (antibiotico A e B). I transconiuganti sono cellule riceventi che mantengono stabilmente il plasmide coniugativo del donatore.
Le cellule donatrici sono resistenti a un antibiotico (antibiotico A) e sono sensibili al marcatore o ai marcatori utilizzati per selezionare le cellule riceventi (antibiotico B). La posizione genomica del gene di resistenza agli antibiotici (cioè, se si trova nel cromosoma o in un plasmide della cellula donatrice) non deve essere nota a priori, perché la mobilizzazione dei marcatori di resistenza agli antibiotici al ricevente (dopo un contatto diretto donatore-ricevente) implica che i marcatori forniti dal donatore fossero in un plasmide.
Un ceppo ricevente (noto per assumere plasmidi coniugativi) deve avere un marcatore stabile selezionabile non presente nel donatore; Questo marcatore selezionabile è generalmente resistente a un antibiotico o biocida situato nel cromosoma. La selezione del ricevente da utilizzare negli esperimenti di accoppiamento è fondamentale, perché alcuni ceppi di E. coli variano nella loro capacità di assumere plasmidi coniugativi16.
Una volta che questi componenti sono stati stabiliti, qualsiasi colonia che cresce su terreni con entrambi gli antibiotici (A e B) dopo un contatto di coppia donatore-ricevente è un transconiugante putativo (Figura 1). Ciò presuppone che i donatori possano crescere nei terreni con l’antibiotico A ma non possano crescere nei terreni con l’antibiotico B, e che i riceventi siano in grado di crescere nei terreni con l’antibiotico B, ma non in grado di crescere con l’antibiotico A. La transconiugazione può essere confermata utilizzando due test diagnostici. Il primo test consiste nella rilevazione (mediante amplificazione di geni mediante reazione a catena della polimerasi [PCR] o altri metodi) di geni presenti nel plasmide coniugativo in colonie transconiuganti. Il secondo test prevede l’uso di marcatori di colore differenziale delle colonie basati sul metabolismo del lattosio. Il colore differenziale della colonia è rivelato dall’uso dell’agar MacConkey; Il lattosio nell’agar può essere utilizzato come fonte di fermentazione da microrganismi fermentanti del lattosio (lac+). Questi microrganismi producono acidi organici, in particolare acido lattico, che abbassano il pH. Il rosso neutro è un indicatore di pH incluso nel mezzo che passa dal bianco sporco al rosso brillante / rosa quando il pH scende al di sotto di 6,817. Pertanto, i ceppi positivi al lattosio di E. coli producono colonie rosa più grandi sull’agar MacConkey, mentre i ceppi negativi al lattosio producono colonie giallo pallido e colonie più piccole sull’agar MacConkey.
Figura 1: Disegno sperimentale utilizzato per rilevare la presenza di plasmidi coniugativi nei ceppi donatori. In questo esempio, il donatore porta un plasmide coniugativo con un gene di resistenza agli antibiotici che conferisce resistenza all’antibiotico A, ma sono sensibili all’antibiotico B. Al contrario, il ricevente ha un determinante di resistenza cromosomica che conferisce protezione dall’antibiotico B, ma è suscettibile all’antibiotico A. I transconiuganti sono resistenti a entrambi gli antibiotici (A e B), perché hanno il plasmide coniugativo del donatore che conferisce resistenza all’antibiotico A e il cromosoma del ricevente che conferisce protezione dall’antibiotico B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il tasso di coniugazione per una coppia donatore-ricevente (in determinate condizioni sperimentali) può essere calcolato dividendo il numero di transconiuganti per il numero di donatori o per il numero di riceventi; Il primo tasso indica la frazione di cellule donatrici che mostrano espressione funzionale del meccanismo di coniugazione da parte del donatore16,18, mentre il secondo tasso indica la capacità del ricevente di assumere plasmidi coniugativi 19,20. In questo studio, salvo diversa indicazione, il tasso di coniugazione rappresenta la frazione di cellule riceventi che diventano transconiuganti (cioè tasso per ricevente).
Qui, vengono riportati due esperimenti di accoppiamento indipendenti, che coinvolgono un ricevente di E. coli e due donatori di E. coli. Inoltre, sono stati utilizzati diversi antibiotici per selezionare i coniuganti per uno dei donatori per confermare che un singolo plasmide multiresistente può essere selezionato con uno qualsiasi dei geni di resistenza agli antibiotici presenti nel plasmide coniugativo.
I ceppi donatori e riceventi utilizzati in questo lavoro sono stati completamente sequenziati per comprendere tutte le componenti di questo sistema sperimentale; Tuttavia, questi protocolli sono stati progettati per lo screening della presenza di plasmidi coniugativi in ospiti di sequenza sconosciuta, e possono essere utilizzati anche in questo contesto sperimentale; Tuttavia, in questo caso, i geni rilevanti vengono sequenziati per primi.
I ceppi donatori e riceventi utilizzati nel protocollo sono i seguenti:
Donatore 1. Coli SW4955 è stato raccolto in un lago a Baton Rouge (LA, USA). Ha un plasmide coniugativo di 134.797 bp (p134797) con risposte IncFIC (FII) e IncFIB (AP001918). Questo plasmide coniugativo ha geni che conferiscono resistenza alle cefalosporine di terza generazione (blaCTX-M-55), aminoglicosidi (aac(3)-IIa e aadA1), fenicoli (catA2), tetracicline (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) e sulfonamidi (sul3). Per una mappa completa di p134797, vedere la Figura 2A. Coli SW4955 è positivo al lattosio e produce colonie rosa sull’agar MacConkey.
Donatore 2. Coli SW7037 è stato raccolto nel lago Erie (Ottawa County, OH, USA). Porta un plasmide coniugativo di 101.718 bp (p101718) con un replica IncI1-I(Alpha). Questo plasmide coniugativo ha un gene che conferisce resistenza ai beta-lattamici (blaCMY-2). Per una mappa completa di p101718, vedere la Figura 2B. Coli SW7037 è anche positivo al lattosio, producendo colonie rosa su agar MacConkey.
Figura 2: Mappa genetica dei plasmidi coniugativi utilizzati in questo studio . (A) Plasmide p134797, il plasmide coniugativo trovato nel ceppo SW4955 di E. coli. (B) Plasmide p101718, il plasmide coniugativo trovato nel ceppo SW7037 di E. coli. I geni di resistenza agli antibiotici sono evidenziati in blu e i geni appartenenti all’apparato coniugativo sono evidenziati in rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Destinatario. Coli LMB100 viene utilizzato come destinatario. Questo è un ceppo senza plasmide resistente alla rifampicina (100 mg / L) e alla streptomicina (100 mg / L). Avere resistenza a due antibiotici riduce la possibilità che si verifichino mutazioni di resistenza nel donatore che interferirebbero con l’interpretazione dei risultati. Inoltre, E. coli LMB100 è negativo al lattosio e può essere distinto dai due ceppi donatori perché produce colonie giallo pallido e piccole (al contrario di colonie rosa più grandi) su agar MacConkey.
Quando il donatore è negativo al lattosio, si consiglia di utilizzare un ricevente positivo al lattosio (ad esempio, E. coli J53). I ceppi LMB100 e J53 sono disponibili per altri laboratori per l’uso. Si prega di inviare una richiesta al Dr. Gerardo Cortés-Cortés insieme a un indirizzo e un numero FedEx.
Il terreno solido necessario per selezionare e contare donatori, riceventi e transconiuganti è l’agar MacConkey in piastre di Petri di 100 mm di diametro. È necessaria l’aggiunta dei seguenti antibiotici: (i) Media A: carbenicillina (100 mg/L) per contare i donatori e per garantire che i riceventi non possano crescere con questo antibiotico. (ii) Media B: rifampicina (100 mg/L) + streptomicina (100 mg/L) per contare i riceventi e garantire che i donatori non possano crescere in questi due antibiotici. iii) Media AB: carbenicillina (100 mg/L) + rifampicina (100 mg/L) + streptomicina (100 mg/L) per ottenere e contare i coniuganti. (iv) Media C: nessun antibiotico per strisciare tutti gli isolati studiati.
Vengono confrontati i tassi di coniugazione dei plasmidi coniugativi da E. coli SW4955 ed E. coli SW7037 a E. coli LMB100. Inoltre, nel caso del plasmide coniugativo p134797 (ceppo SW4955), l’antibiotico carbenicillina (100 mg/L) viene sostituito da gentamicina (2 mg/L), cloramfenicolo (25 mg/L), tetraciclina (10 mg/L), trimetoprim (20 mg/L) o sulfametossazolo (100 mg/L) in esperimenti successivi per stabilire se il marcatore di resistenza agli antibiotici utilizzato per la selezione abbia un impatto sui risultati.
Protocol
Representative Results
Discussion
I plasmidi coniugativi forniscono l’accesso a un pool comune di geni all’interno di un particolare ambiente ambientale attraverso la ricombinazione e il trasferimento genico orizzontale34. Pertanto, i plasmidi coniugativi sono entità evolutive in grado di acquisire e conferire funzioni che consentono ai batteri di adattarsi a molteplici condizioni (tra cui resistenza agli antibiotici, resistenza ai metalli, acquisizione di metalli, formazione di biofilm e geni patogeni, tra gli altri) entro una scala temporale di ore.
Questo lavoro presenta un protocollo per l’identificazione di plasmidi coniugativi nei batteri. Affinché il protocollo funzioni, i marcatori utilizzati devono differenziare i ceppi del donatore e del ricevente, come mostrato dai controlli nei mezzi A e B. Hanno anche bisogno di selezionare efficacemente le cellule che trasportano il plasmide. La reazione di accoppiamento è fondamentale. In questa reazione, donatori e riceventi devono stabilire un contatto prolungato (attraverso pili) affinché avvenga la coniugazione. Tutto ciò che può interrompere il contatto cellula-cellula, come un tempo di incubazione insufficiente o agitare o mescolare la coltura, diminuisce quindi l’efficienza della coniugazione. Anche la scelta del ricevente è critica, poiché alcuni ceppi riceventi sono refrattari alla coniugazione35,36. LMB100 si propone come destinatario di scelta, in quanto è in grado di prendere plasmidi di più tipi di incompatibilità.
Il tasso di coniugazione è specifico per ogni coppia cromosomica plasmide-donatore, ricevente e condizione ambientale. La coniugazione di plasmidi specifici è risultata sensibile a un gran numero di variabili, tra cui la fase di crescita, la densità cellulare, il rapporto donatore-ricevente, se la coniugazione è condotta in mezzi liquidi o solidi, carbonio, ossigeno, sali biliari, concentrazioni di metalli, presenza di cellule di mammifero, temperatura, pH e tempo di accoppiamento13,14,15 . Lo studio di queste interazioni dipende dalla rilevazione iniziale di un plasmide coniugativo da studiare in profondità. Pertanto, il protocollo qui descritto può anche essere modificato per esplorare l’impatto di diverse variabili sperimentali, sebbene ciò avvenga al costo di limitare il numero di donatori sottoposti a screening. Può anche identificare plasmidi mobilizzabili in ospiti che hanno plasmidi helper (cioè plasmidi che consentono la coniugazione fornendo funzioni mancanti dai plasmidi mobilizzabili in trans6).
Si raccomanda di conoscere la sequenza del plasmide coniugativo (ma non è necessario per rilevare la coniugazione, come discusso sopra). Quando i donatori sono negativi al lattosio (producono colonie gialle su agar MacConkey), un ricevente positivo al lattosio (che produce colonie rosa su agar MacConkey) può essere utilizzato per distinguere i veri transconiuganti dalle cellule donatrici che sono in grado di crescere sul terreno per selezionare i transconiuganti. Il protocollo qui descritto è progettato per rilevare plasmidi coniugativi da membri ambientali, commensali e patogeni della famiglia delle Enterobacteriaceae; Tuttavia, può essere utilizzato con qualsiasi specie batterica con un donatore, un ricevente, uno o più antibiotici e marcatori colorati adatti. L’identificazione di questi componenti critici in altri batteri richiede studi sistematici utilizzando più donatori, riceventi e marcatori (antibiotici e coloranti). Questo protocollo non è stato testato nei batteri Gram-positivi.
Diverse varianti del metodo qui presentato sono state riportate in letteratura, recentemente recensite20. Il risultato qualitativo può anche essere indicato in modi diversi (ad esempio, frequenza dell’exconiugante e frequenza di trasferimento genico), e le unità adimensionali possono essere utilizzate per riportare l’efficienza di coniugazione (mL / CFU x h) 20.
Il protocollo qui descritto risolve diverse limitazioni precedentemente non affrontate dai metodi esistenti16,18,19,20. In primo luogo, è stato identificato un destinatario adatto. In secondo luogo, l’uso di due antibiotici (rifampicina e streptomicina) per selezionare i veri coniuganti riduce al minimo la possibilità che i donatori sviluppino resistenza a uno degli antibiotici usati per selezionare i transconiuganti attraverso la mutagenesi spontanea. I falsi transconiuganti possono anche derivare dalla protezione degli astanti mediante idrolisi dell’antibiotico utilizzato per selezionare i transconiuganti da parte di enzimi (ad esempio, beta-lattamasi) prodotti in grandi quantità dal donatore. In terzo luogo, sono inclusi diversi controlli sperimentali per garantire che il prodotto dell’accoppiamento sia un vero transconiugante (cioè una cellula ricevente che ha incorporato stabilmente il plasmide coniugativo del donatore). Qui, abbiamo presentato due metodi indipendenti per testare l’autenticità dei transconiuganti, vale a dire un marcatore colorimetrico in agar MacConkey e il rilevamento PCR dei geni replicons e di resistenza agli antibiotici del plasmide coniugativo nel ricevente. Inoltre, il protocollo qui descritto è progettato per isolare e caratterizzare plasmidi coniugativi da membri ambientali, commensali e patogeni della famiglia Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella e altre specie).
Per comprendere la meccanica della coniugazione, le osservazioni sperimentali sono state modellate utilizzando simulazioni al computer. Questi modelli predittivi stimano la frequenza del trasferimento del plasmide per determinate densità di crescita di donatori, riceventi e transconiuganti. Un modello noto come modello endpoint ha trovato soglie al di sopra delle quali il tasso di trasferimento del plasmide in coltura liquida e ha concluso che la velocità di trasferimento non è influenzata dalla densità cellulare, dal rapporto donatore/ricevente e dal tempo di accoppiamento19. L’ibridazione fluorescenza in situ (FISH) è stata utilizzata come metodo alternativo di rilevamento plasmidico transconiugante. FISH consente la visualizzazione del plasmide utilizzando la microscopia a fluorescenza attraverso l’ibridazione di una sonda di DNA e di un DNA bersaglio. Pertanto, la FISH consente la rilevazione visiva dei flussi plasmidici attraverso diverse popolazioni cellulari37, sebbene non abbia lo stesso livello di sensibilità del metodo qui presentato se i transconiuganti vengono rilevati mediante screening visivo anziché selezione.
C’è un enorme bisogno di comprendere la biologia dei plasmidi coniugativi che stanno disperdendo i geni di resistenza agli antibiotici attraverso diversi componenti dell’ecosistema (clinica, agricoltura, fognature, fauna selvatica, animali domestici, suoli, fiumi e laghi). In sintesi, le condizioni sperimentali semplificate presentate nei protocolli qui descritti facilitano lo screening dei donatori su larga scala, e rappresentano quindi uno strumento chiave per lo studio del trasferimento genico orizzontale originato nei plasmidi coniugativi da una varietà di fonti. Possono essere utilizzati per studiare la prevalenza di geni di resistenza agli antibiotici o altri geni clinicamente rilevanti nei plasmidi coniugativi provenienti da più fonti e batteri. Possono anche essere adattati per lo studio della coniugazione in vivo (ad esempio, nell’intestino dei vertebrati) e per studiare le condizioni che modulano l’efficienza della coniugazione. Tutti questi studi contribuiranno notevolmente alla comprensione di come la mobilizzazione dei plasmidi coniugativi multiresistenti contribuisca alla diffusione della resistenza multifarmaco.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LM-B, IMG, AT e IS sono stati supportati dalla sovvenzione NIH GM055246 assegnata a LM-B. GC-C ha ricevuto la borsa di studio post-dottorato UC MEXUS-CONACYT per due anni consecutivi: AA 2017-18 e 2018-19. Ringraziamo vivamente gli studenti Sage Chavez e Pepper St. Clair del programma di mentoring Academic Inspiration Network (GAIN) sponsorizzato dalla Genentech-Foundation per il loro supporto tecnico negli esperimenti.
Materials
| 1.5 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 22-313630 | It can be replaced for another brand |
| 2.0 mL Cryogenic vials | Corning | 430659 | It can be replaced for another brand |
| 14 mL conical tubes | FALCON | 149597 | It can be replaced for another brand |
| 14 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 8850 | It can be replaced for another brand |
| 1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N0552G | |
| 250 mL sterile flasks | PYREX | 5320 | It can be replaced for another permanent marker brand |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38SI-212 | It can be replaced for another brand |
| Agarose (molecular biology grade, multipurpose) | Fisher Scientific | BP160-500 | It can be replaced for another brand |
| Carbenicillin | GOLD BIOTECHNOLOGY | C-103-50 | It can be replaced for another brand |
| Disposable inoculating loops: 1 µL | Fisherbrand | 22-363-595 | It can be replaced for another brand |
| DNA gel loading dye 6x | New England Biolabs | B7024S | It can be replaced for another brand |
| EDTA | Fisher Scientific | BP119-500 | It can be replaced for another brand |
| Electronic digital scale | Denver Instrument | APX-2001 | It can be replaced for another brand |
| Eppendorf conical tubes: 1.5 mL | Eppendorf | 14-282-302 | It can be replaced for another brand |
| Equipment for agarose gel electrophoresis | Fisher Scientific | FP300 | It can be replaced for another brand |
| Ethanol-resistant markers | Sharpie | 37001; 37002; 37003 | It can be replaced for another brand |
| Gel documentation systems (UVP GelSolo) | Analytakjena | SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 | It can be replaced for another brand |
| Gloves | X-GEN | 44-100M | Any nitrile gloves brand works |
| Ice bucket | Thermo Fisher Scientific | 432128 | It can be replaced for another brand |
| MacConkey agar | BD DIFCO | 212123 | |
| Master Mix | BioLabs | M0496S | It can be replaced for another brand |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | It can be replaced for another brand |
| Microcentrifuge tubes: 2.0 mL | Fisherbrand | 05-408-138 | It can be replaced for another brand |
| Mueller Hinton agar | BD DIFCO | DF0479-17-3 | |
| Mueller Hinton broth | BD DIFCO | 275730 | |
| NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL | 740588. 250 | |
| PCR tube racks | AXYGEN | R96PCRFSP | It can be replaced for another brand |
| PCR tubes (0.2 mL) | AXYGEN | PCR-02-C | It can be replaced for another brand |
| Rifampicin | Fisher Scientific | 50-164-7517 | |
| Set of micropipettes that dispense between 1 – 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) | RAININ | 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 | Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-3 | It can be replaced for another brand |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | 335905P | It can be replaced for another brand |
| Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL | Eclipse | 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 | It can be replaced for another brand |
| Streptomycin | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| Taq DNA Polymerase | BioLabs | M0273S | |
| Thermal cycler C1000 Touch | Bio-Rad | 1851196 | It can be replaced for another brand |
| Tris | Fisher Scientific | BP153-500 | It can be replaced for another brand |
References
- Lederberg, J., Tatum, E. Gene recombination in Escherichia coli. Nature. 158 (4016), 558 (1946).
- de la Cruz, F., Frost, L. S., Meyer, R. J., Zechner, E. L. Conjugative DNA metabolism in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (1), 18-40 (2010).
- Grohmann, E., Muth, G., Espinosa, M. Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (2), 277-301 (2003).
- Koraimann, G., Wagner, M. A. Social behavior and decision making in bacterial conjugation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 54 (2014).
- Dziewit, L., et al. Diversity and role of plasmids in adaptation of bacteria inhabiting the Lubin copper mine in Poland, an environment rich in heavy metals. Frontiers in Microbiology. 6, 152 (2015).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
- Balbuena-Alonso, M. G., et al. Genomic analysis of plasmid content in food isolates of E. coli strongly supports its role as a reservoir for the horizontal transfer of virulence and antibiotic resistance genes. Plasmid. 123-124, 102650 (2022).
- San Millan, A., MacLean, R. C. Fitness costs of plasmids: A limit to plasmid transmission. Microbiol Spectrum. 5 (5), (2017).
- Coluzzi, C., Garcillán-Barcia, M. P., de la Cruz, F., Rocha, E. P. C. Evolution of plasmid mobility: Origin and fate of conjugative and nonconjugative plasmids. Molecular Biology and Evolution. 39 (6), 1-23 (2022).
- Bevan, E. R., et al. Molecular characterization of plasmids encoding blaCTX-M from faecal Escherichia coli in travellers returning to the UK from South Asia. The Journal of Hospital Infection. 114, 134-143 (2021).
- Minja, C. A., Shirima, G., Mshana, S. E. Conjugative plasmids disseminating CTX-M-15 among human, animals and the environment in Mwanza Tanzania: a need to intensify one health approach. Antibiotics. 10 (7), 836 (2021).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. International Journal of Medical Microbiology. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Sengupta, M., Austin, S. Prevalence and significance of plasmid maintenance functions in the virulence plasmids of pathogenic bacteria. Infection and Immunity. 79 (7), 2502-2509 (2011).
- Alderliesten, J. B., et al. Effect of donor-recipient relatedness on the plasmid conjugation frequency: a meta-analysis. BMC Microbiology. 20 (1), 135 (2020).
- Neil, K., Allard, N., Rodrigue, S. Molecular mechanisms influencing bacterial conjugation in the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 12, 673260 (2021).
- Liu, G., Bogaj, K., Bortolaia, V., Olsen, J. E., Thomsen, L. E. Antibiotic-induced, increased conjugative transfer is common to diverse naturally occurring ESBL plasmids in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 2119 (2019).
- Suchman, E. Polymerase chain reaction protocol. American Society for Microbiology. , 1-14 (2011).
- Watanabe, T. Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria. Bacteriological Reviews. 27 (1), 87-115 (1963).
- Simonsen, L., Gordon, D. M., Stewart, F. M., Levin, B. R. Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method. Journal of General Microbiology. 136 (11), 2319-2325 (1990).
- Huisman, J. S., et al. Estimating plasmid conjugation rates: A new computational tool and a critical comparison of methods. Plasmid. 121, 102627 (2022).
- Jung, B., Hoilat, G. J. MacConkey medium. StatPearls. , (2022).
- . NucleoSpin Plasmid DNA purification Available from: https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf (2022)
- Jiang, X., et al. Detection of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9), 2990-2995 (2006).
- Stapleton, P. D., Shannon, K. P., French, G. L. Carbapenem resistance in Escherichia coli associated with plasmid-determined CMY-4 beta-lactamase production and loss of an outer membrane protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (5), 1206-1210 (1999).
- Ben Yahia, H., et al. Detection of CTX-M-15 harboring Escherichia coli isolated from wild birds in Tunisia. BMC Microbiology. 18 (1), 26 (2018).
- Madsen, L., Aarestrup, F. M., Olsen, J. E. Characterisation of streptomycin resistance determinants in Danish isolates of Salmonella Typhimurium. Veterinary Microbiology. 75 (1), 73-82 (2000).
- Perreten, V., Boerlin, P. A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (3), 1169-1172 (2003).
- Guardabassi, L., Dijkshoorn, L., Collard, J. M., Olsen, J. E., Dalsgaard, A. Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains. Journal of Medical Microbiology. 49 (10), 929-936 (2000).
- Carattoli, A., et al. Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. Journal of Microbiological Methods. 63 (3), 219-228 (2005).
- Green, M. R., Sambrook, J. Agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor protocols. 2019 (1), (2019).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutation Research. 439 (1), 37-47 (1999).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators. Analytical Biochemistry. 268 (2), 278-288 (1999).
- Oatey, P. Imaging fluorescently stained DNA with CCD technology How to increase sensitivity and reduce integration times. Biotechniques. 42 (3), 376-377 (2007).
- Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Conjugative plasmids: vessels of the communal gene pool. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 364 (1527), 2275-2289 (2009).
- Du, L., Liu, R. H., Ying, L., Zhao, G. R. An efficient intergeneric conjugation of DNA from Escherichia coli to mycelia of the lincomycin-producer Streptomyces lincolnensis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 4797-4806 (2012).
- Kirk, J. A., Fagan, R. P. Heat shock increases conjugation efficiency in Clostridium difficile. Anaerobe. 42, 1-5 (2016).
- Esteves, G. M., Pereira, J. A., Azevedo, N. F., Azevedo, A. S., Mendes, L. Friends with benefits: An inside look of periodontal microbes’ interactions using fluorescence in situ hybridization-Scoping review. Microorganisms. 9 (7), 1504 (2021).
