Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in <em>E. coli</em>

Luis Mota-Bravo; Manel Camps; Iv&#225;n Mu&#241;oz-Guti&#233;rrez; Andrey Tatarenkov; Caison Warner; Isabel Suarez; Gerardo Cort&#233;s-Cort&#233;s

doi:10.3791/64523

JoVE Journal > Genetics

Genetics

Detecção de Transferência Horizontal de Genes Mediada por Plasmídeos Conjugativos Naturais em E. coli

Published: March 24, 2023

doi:

10.3791/64523

Luis Mota-Bravo¹, Manel Camps², Iván Muñoz-Gutiérrez¹, Andrey Tatarenkov¹, Caison Warner², Isabel Suarez¹, Gerardo Cortés-Cortés²

¹School of Biological Sciences,University of California Irvine, ²Department of Microbiology & Environmental Toxicology,University of California Santa Cruz

Summary

A conjugação medeia a transferência horizontal de genes mobilizando o DNA plasmídico através de duas células diferentes, facilitando a disseminação de genes benéficos. Este trabalho descreve um método amplamente utilizado para a detecção eficiente da transferência conjugativa de plasmídeos, baseado no uso de marcadores diferenciais no plasmídeo conjugativo, doador e receptor para detectar a transconjugação.

Abstract

A conjugação representa um dos principais mecanismos que facilitam a transferência horizontal de genes em bactérias Gram-negativas. Este trabalho descreve métodos para o estudo da mobilização de plasmídeos conjugativos de ocorrência natural, utilizando como exemplo dois plasmídeos de ocorrência natural. Esses protocolos dependem da presença diferencial de marcadores selecionáveis no plasmídeo doador, receptor e conjugativo. Especificamente, os métodos descritos incluem 1) a identificação de plasmídeos conjugativos naturais, 2) a quantificação das taxas de conjugação em cultura sólida e 3) a detecção diagnóstica dos genes de resistência a antibióticos e tipos de replicões plasmídicos em receptores transconjugantes por reação em cadeia da polimerase (PCR). Os protocolos aqui descritos foram desenvolvidos no contexto do estudo da ecologia evolutiva da transferência horizontal de genes, para rastrear a presença de plasmídeos conjugativos portadores de genes de resistência a antibióticos em bactérias encontradas no ambiente. A transferência eficiente de plasmídeos conjugativos observada nesses experimentos em cultura destaca a relevância biológica da conjugação como um mecanismo que promove a transferência horizontal de genes em geral e a disseminação da resistência aos antibióticos em particular.

Introduction

Em 1946, Lederberg e Tatum¹ descreveram um processo sexual em Escherichia coli K-12 que agora é conhecido como conjugação. A conjugação bacteriana é o processo pelo qual uma célula bacteriana (o doador) transfere unidirecionalmente material genético para outra célula (o receptor) por contato direto célula-a-célula. A conjugação é amplamente distribuída em bactérias^2,3^, embora a fração de células doadoras que expressam a maquinaria de conjugação seja tipicamente muito pequena⁴.

Os plasmídeos são elementos de DNA extracromossômico que se replicam de forma autônoma. Além dos genes envolvidos na replicação e manutenção dos plasmídeos, os plasmídeos frequentemente carregam uma carga de genes envolvidos na adaptação a desafios ambientais, como metais pesados ou exposição a antibióticos⁵. Os plasmídeos conjugativos são uma classe de plasmídeos com um conjunto de genes especializados que permitem sua transferência para as células receptoras e sustentam sua persistência após a transferência⁶. Os plasmídeos conjugativos variam em tamanho de 21,8 kb a 1,35 Mb em bactérias do filo Pseudomonadota (sinônimo de Proteobacteria), com mediana em torno de 100 kb ^5,7. Eles também geralmente têm um baixo número de cópias, possivelmente para manter a carga metabólica sobre o hospedeiro baixa ^8,9.

O aparelho conjugativo típico é composto por quatro componentes: uma origem de transferência (oriT), uma relaxase, uma proteína de acoplamento tipo IV e um sistema de secreção tipo IV (uma estrutura em forma de tubo chamada pilus que permite que os doadores entrem em contato com os receptores)⁶. Apenas uma fração muito pequena de células portadoras de plasmídeos conjugativos expressa a maquinaria de conjugação⁴, mas se os plasmídeos fornecerem uma vantagem de aptidão, os transconjugantes podem se expandir rapidamente na população. Entre 35% e mais de 80% dos isolados de E. coli coletados de diferentes habitats apresentam plasmídeos conjugativos com genes que conferem resistência a pelo menos um antibiótico^10,11; portanto, a transferência horizontal de genes mediada por plasmídeos conjugativos é um dos principais mecanismos que impulsionam a disseminação global de genes de resistência a antibióticos¹².

Experimentos de acasalamento realizados em cultura laboratorial mostraram que a frequência de conjugação é afetada por múltiplos fatores, incluindo a natureza das células receptoras, a fase de crescimento, a densidade celular, a relação doador-receptor, se a conjugação é conduzida em meios líquidos ou sólidos, carbono, oxigênio, sais biliares, concentrações de metais, presença de células de mamíferos, temperatura, pH e tempo de acasalamento^13,14^,¹⁵.

Este trabalho descreve protocolos para detectar a presença de plasmídeos conjugativos em uma determinada cepa hospedeira, quantificar as taxas de conjugação em cultura sólida e verificar novamente sua transferência para células receptoras. Esses protocolos podem ser utilizados como um primeiro passo para a identificação de plasmídeos conjugativos naturais adequados para pesquisa. Eles usam um número mínimo de etapas simplificadas porque são projetados para rastrear a presença de plasmídeos conjugativos em bactérias obtidas de múltiplas fontes (ambientais, mensais e patogênicas) em escala (dezenas a centenas de doadores).

Além disso, são mostrados testes para detectar se a mobilização de um determinado plasmídeo conjugativo é independente do antibiótico usado para detecção (ou seja, a relevância do gene de resistência a antibióticos sob seleção) e para comparar as taxas de conjugação de dois plasmídeos conjugativos encontrados em diferentes isolados ambientais.

Com base na composição genética dos plasmídeos conjugativos relevantes (replicão plasmídico e composição gênica de resistência a antibióticos), cada etapa do protocolo pode ser modificada para estudar o impacto de uma variedade de fatores que provavelmente afetarão a taxa de conjugação.

Delineamento experimental geral:
Os componentes essenciais necessários para estabelecer um experimento de acasalamento são células doadoras, uma cepa receptora e meios sólidos para selecionar doadores (antibiótico A), receptores (antibiótico B) e transconjugantes (antibióticos A e B). Os transconjugantes são células receptoras que mantêm de forma estável o plasmídeo conjugativo do doador.

As células doadoras são resistentes a um antibiótico (antibiótico A) e são suscetíveis ao marcador ou marcadores usados para selecionar as células receptoras (antibiótico B). A localização genômica do gene de resistência a antibióticos (ou seja, se ele está localizado no cromossomo ou em um plasmídeo da célula doadora) não precisa ser conhecida a priori, porque a mobilização de marcadores de resistência a antibióticos para o receptor (após um contato direto doador-receptor) implica que os marcadores fornecidos pelo doador estavam em um plasmídeo.

Uma cepa receptora (conhecida por tomar plasmídeos conjugativos) precisa ter um marcador selecionável estável não presente no doador; este marcador selecionável é geralmente resistente a um antibiótico ou biocida localizado no cromossomo. A seleção do receptor a ser utilizado em experimentos de acasalamento é fundamental, pois algumas cepas de E. coli variam em sua capacidade de tomar plasmídeos conjugativos¹⁶.

Uma vez estabelecidos esses componentes, qualquer colônia que cresça em meio com antibióticos (A e B) após um contato do par doador-receptor é um suposto transconjugante (Figura 1). Isso está assumindo que os doadores podem crescer em meios com o antibiótico A, mas não podem crescer em meios com o antibiótico B, e que os receptores são capazes de crescer em meios com o antibiótico B, mas não podem crescer com o antibiótico A. A transconjugação pode ser confirmada usando dois testes diagnósticos. O primeiro teste consiste na detecção (por amplificação de genes por reação em cadeia da polimerase [PCR], ou outros métodos) de genes encontrados no plasmídeo conjugativo em colônias transconjugantes. O segundo teste envolve o uso de marcadores diferenciais de cor da colônia com base no metabolismo da lactose. A cor diferencial da colônia é revelada pelo uso do ágar MacConkey; a lactose no ágar pode ser usada como fonte de fermentação por microrganismos fermentadores de lactose (lac⁺). Esses microrganismos produzem ácidos orgânicos, particularmente o ácido lático, que diminuem o pH. O vermelho neutro é um indicador de pH incluído no meio que passa de esbranquiçado para vermelho/rosa brilhante à medida que o pH cai abaixo de 6,8¹⁷. Assim, cepas positivas para lactose de E. coli produzem colônias rosa maiores no ágar MacConkey, enquanto as cepas negativas para lactose produzem colônias amarelas pálidas e menores no ágar MacConkey.

Figura 1: Delineamento experimental utilizado para detectar a presença de plasmídeos conjugativos em cepas doadoras. Neste exemplo, o doador carrega um plasmídeo conjugativo com um gene de resistência a antibióticos que confere resistência ao antibiótico A, mas eles são suscetíveis ao antibiótico B. Por outro lado, o receptor tem um determinante de resistência cromossômica que confere proteção contra o antibiótico B, mas é suscetível ao antibiótico A. Os transconjugantes são resistentes a ambos os antibióticos (A e B), porque eles têm o plasmídeo conjugativo do doador que confere resistência ao antibiótico A e o cromossomo do receptor que confere proteção contra o antibiótico B. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A taxa de conjugação de um par dador-receptor (em determinadas condições experimentais) pode ser calculada dividindo o número de transconjugantes pelo número de dadores ou pelo número de receptores; a primeira taxa indica a fração de células doadoras que exibem expressão funcional da maquinaria de conjugação pelo doador^16,18, enquanto a segunda taxa indica a capacidade do receptor de tomar plasmídeos conjugativos ^19,20. Neste estudo, salvo indicação em contrário, a taxa de conjugação representa a fração de células receptoras que se tornam transconjugantes (ou seja, taxa por receptor).

Aqui, dois experimentos independentes de acasalamento são relatados, envolvendo um receptor de E. coli e dois doadores de E. coli. Além disso, diferentes antibióticos foram usados para selecionar transconjugantes para um dos doadores para confirmar que um único plasmídeo multirresistente pode ser selecionado com qualquer um dos genes de resistência a antibióticos encontrados no plasmídeo conjugativo.

As cepas doadoras e receptoras utilizadas neste trabalho foram totalmente sequenciadas para entender todos os componentes deste sistema experimental; no entanto, esses protocolos foram projetados para rastrear a presença de plasmídeos conjugativos em hospedeiros de sequência desconhecida, podendo ser utilizados também nesse contexto experimental; no entanto, neste caso, os genes relevantes são sequenciados primeiro.

As estirpes dadoras e receptoras utilizadas no protocolo são as seguintes:

Doador 1. E. coli SW4955 foi coletado em um lago em Baton Rouge (LA, EUA). Possui um plasmídeo conjugativo de 134.797 pb (p134797) com emendas IncFIC(FII) e IncFIB (AP001918). Este plasmídeo conjugativo possui genes que conferem resistência a cefalosporinas de terceira geração (bla_CTX-M-55), aminoglicosídeos (aac(3)-IIa e aadA1), fenicolares (catA2), tetraciclinas (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) e sulfonamidas (sul3). Para obter um mapa completo da p134797, consulte a Figura 2A. E. coli SW4955 é lactose-positivo, produzindo colônias rosa em ágar MacConkey.

Doador 2. E. coli SW7037 foi coletado no Lago Erie (Condado de Ottawa, OH, EUA). Ele carrega um plasmídeo conjugativo de 101.718 pb (p101718) com uma emenda IncI1-I(Alpha). Este plasmídeo conjugativo tem um gene que confere resistência aos beta-lactâmicos (bla_CMY-2). Para obter um mapa completo da p101718, consulte a Figura 2B. E. coli SW7037 também é positivo para lactose, produzindo colônias cor-de-rosa no ágar MacConkey.

Figura 2: Mapa genético dos plasmídeos conjugativos utilizados neste estudo . (A) Plasmídeo p134797, o plasmídeo conjugativo encontrado na cepa SW4955 de E. coli. (B) Plasmídeo p101718, o plasmídeo conjugativo encontrado na estirpe SW7037 de E. coli. Os genes de resistência a antibióticos são destacados em azul e os genes pertencentes ao aparelho conjugativo são destacados em vermelho. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Destinatário. E. coli LMB100 é usado como destinatário. Esta é uma estirpe sem plasmídeos que é resistente à rifampicina (100 mg/L) e à estreptomicina (100 mg/L). Ter resistência a dois antibióticos reduz a possibilidade de surgirem mutações de resistência no doador que interfeririam na interpretação dos resultados. Além disso, a E. coli LMB100 é negativa à lactose e pode ser distinguida das duas cepas doadoras porque produz colônias amarelas pálidas e pequenas (em oposição às colônias maiores e rosas) no ágar MacConkey.

Quando o doador é lactose-negativo, recomendamos o uso de um receptor positivo para lactose (por exemplo, E. coli J53). As cepas LMB100 e J53 estão disponíveis para outros laboratórios para uso. Por favor, envie um pedido ao Dr. Gerardo Cortés-Cortés juntamente com um endereço e número FedEx.

O meio sólido necessário para selecionar e contar doadores, receptores e transconjugantes é o ágar MacConkey em placas de Petri de 100 mm de diâmetro. É necessária a adição dos seguintes antibióticos: (i) Média A: carbenicilina (100 mg/L) para contar os dadores e garantir que os recetores não podem crescer com este antibiótico. ii) Meios B: rifampicina (100 mg/L) + estreptomicina (100 mg/L) para contar os recetores e garantir que os dadores não podem crescer nestes dois antibióticos. iii) Meios AB: carbenicilina (100 mg/L) + rifampicina (100 mg/L) + estreptomicina (100 mg/L) para obtenção e contagem de transconjugantes. iv) Meios C: ausência de antibióticos para riscar todos os isolados estudados.

As taxas de conjugação de plasmídeos conjugativos de E. coli SW4955 e E. coli SW7037 a E. coli LMB100 são comparadas. Além disso, no caso do plasmídeo conjugativo p134797 (cepa SW4955), o antibiótico carbenicilina (100 mg/L) é substituído por gentamicina (2 mg/L), cloranfenicol (25 mg/L), tetraciclina (10 mg/L), trimetoprim (20 mg/L) ou sulfametoxazol (100 mg/L) em experimentos subsequentes para estabelecer se o marcador de resistência a antibióticos usado para seleção tem algum impacto nos resultados.

Protocol

1. Método 1: Conjugação Dia 1: Estrie os doadores e receptores. Estrie separadamente dos estoques de glicerol no meio C (ágar MacConkey sem antibióticos) e incube durante a noite a 37 °C.NOTA: Esta etapa é necessária para garantir que o experimento seja conduzido com isolados puros e para confirmar o fenótipo da lactose pela cor das colônias. Dia 2: Rotule um tubo de cultura de 14,0 mL para cada doador e receptor. Selecione uma única colônia de cada doador e receptor e cultive-os durante a noite (18 h) em tubos de cultura separados de 14,0 mL contendo 2 mL de caldo Mueller Hinton a 37 °C e agitando a 200 rpm.NOTA: Nas cepas utilizadas, a fase estacionária é atingida após a cultura noturna de 18 h. Dia 3: Medir a densidade óptica a 600 nm (OD600) da cultura noturna de cada doador e receptor (sem vórtice) usando uma diluição de 1:10 de 900 μL de solução salina e 100 μL da cultura noturna. Ajustar a densidade óptica de cada doador e receptor para 2,0 (OD600 = 2,0) com solução salina esterilizada (NaCl a 0,85% em água).NOTA: Uma cultura noturna de E. coli com uma OD600 = 2,0 tem 1,6 x 109 UFC/mL. Rotule um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL de “tubo de acasalamento”, indicando as cepas doadora e receptora. Transfira 500 μL da suspensão ajustada (OD600 = 2,0) de cada doador e receptor, e coloque-os no tubo de acasalamento (este tubo de acasalamento teria 0,8 x 109 UFC/mL de cada doador e receptor). Misture suavemente o tubo de acasalamento por inversão. Centrifugar o tubo de acasalamento durante 10 min a 500 x g à temperatura ambiente. Sem perturbar o pellet, pipetar 800 μL do tubo de conjugação. Deve haver 200 μL restantes no tubo de conjugação.NOTA: Descarte o sobrenadante para um recipiente de 10% de água sanitária para desativar as bactérias na suspensão. Incubar o tubo de acasalamento durante 18 h (durante a noite) a 37 °C numa incubadora. O acasalamento ocorre durante o tempo de incubação.NOTA: Este passo deve ser feito sem agitação para não quebrar o pili conjugativo. Como controle negativo, faça a cultura noturna de doadores no meio B e receptores no meio A. Incubar as placas durante a noite a 37 °C Dia 4: Adicionar 800 μL de solução salina ao tubo de acasalamento e vórtice para ressuspensão (isso reconstitui a mistura de acasalamento para 1 mL).NOTA: O vórtice separa as bactérias do acasalamento e homogeneiza a cultura para quantificar a UFC/mL. Preparar diluições 1:10 (de 1 x 100 a 1 x 10-7) da mistura de acasalamento. Placa 100 μL de diluições 10-5 a 10-7 nos meios A e B e todas as diluições nos meios AB.NOTA: A deluição 100 refere-se ao tubo puro. Deixe as placas secarem antes de colocá-las na incubadora de cabeça para baixo. Incubar as placas durante 18 h (durante a noite) a 37 °C. Dia 5: Inspecione os controles negativos para garantir que as listras de culturas puras durante a noite de doadores não crescessem na mídia B, e a cultura pura da noite para o dia dos receptores não crescesse na mídia A. Registre o número de colônias e diluições que podem ser contadas:Contar as colônias na mídia A; estes são os doadores. As colônias devem ser cor-de-rosa (Figura 3A,B). Contar as colônias na mídia B; estes são os receptores e transconjugantes. As colônias devem ser amarelo-pálidas (Figura 3C). Contar as colônias na mídia AB; estes são os transconjugantes. As colônias devem ser amarelo pálido.NOTA: Selecione uma placa contável. Uma placa contável tem entre 30 e 300 colônias (mais de 300 colônias seriam difíceis de contar, e menos de 30 colônias são consideradas um tamanho de amostra muito pequeno para apresentar uma representação precisa da amostra original). Calcular a frequência de conjugação por dador ou por receptorFrequência de conjugação por doador = (UFC/mL do transconjugante [AB médio])/ (UFC/mL de doadores [meio A]) x 100Frequência de conjugação por receptor = (UFC/mL do transconjugante [AB médio])/ (UFC/mL de receptores e transconjugantes [meio B]) x 100NOTA: A frequência de conjugação para este protocolo foi calculada como transconjugantes divididos pelo número do receptor, multiplicado por 100. De acordo com a literatura, a quantidade resultante de conjugação poderia ser nomeada como frequência exconjugante, frequência de transferência de genes, frequência de conjugação, rendimento recombinante, eficiência de transferência de plasmídeos, frequência de conjugação com base na contagem bacteriana total, proporção de transconjugantes, fração de transconjugantes na população receptora, frequência transconjugante, frequência de conjugação, logaritmo da taxa de conjugação, taxa de transferência constante, taxa de conjugação por par de acasalamento, coeficiente de conjugação ou eficiência de conjugação20. Este protocolo refere-se ao termo eficiência de conjugação. Conservar os transconjugantes em reservas de glicerol a -80 °C. Siga os subpassos para preparar estoques de glicerol.Selecione uma única colônia de transconjugantes e cultive-os durante a noite (18 h) em tubos de cultura de 5,0 mL contendo 2 mL de caldo Mueller Hinton suplementado com carbenicilina (100 mg/L), a 37 °C e agitando a 200 rpm. Rotular frascos criogênicos, indicando o nome do transconjugante, da seguinte forma: Tc + nome do doador + antibiótico de seleção na mídia A (como são transconjugantes, sabe-se que seu fundo é a cepa receptora, que já é resistente à estreptomicina e rifampicina, mas também abriga o plasmídeo que carrega um gene de resistência a beta-lactâmicos); por exemplo, TcU1Carb. Adicione números contínuos caso mais de um transconjugante do mesmo doador precise ser armazenado (por exemplo, TcU1Carb1, TcU1Carb2, etc.). Transfira 1 mL da cultura noturna para 1 mL de glicerol a 50% (v/v; a concentração final de glicerol deve ser de 25%) e misture suavemente por inversão. Colocar os frascos criogénicos em gelo seco durante 15 min e armazenar os criovios a -80 °C para experiências futuras. Para a extracção de ADN, riscar os trasnconjugantes das reservas de glicerol em ágar Mueller Hinton suplementado com carbenicilina (100 mg/L) e incubar durante a noite a 37 °C; em seguida, siga as recomendações da etapa 2.1. 2. Método 2: Reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar genes de resistência a antibióticos e replicões plasmídicas em transconjugantes de E. coli NOTA: A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi desenvolvida pelo Dr. Kary Mullis em 1983. A PCR depende de primers específicos (um pequeno pedaço de DNA complementar a uma determinada sequência de DNA que atua como um ponto no qual a replicação pode prosseguir, geralmente 20-40 nucleotídeos de comprimento e, idealmente, com um teor de guanina-citosina de 40%-60%), que são recozidos para cadeias opostas de um molde de DNA desnaturado e de fita dupla e estendidos através de uma DNA polimerase termoestável, gerando assim um modelo adicional para o próximo ciclo de reações, levando à amplificação exponencial do modelo original21. Neste protocolo, os replicões e genes de resistência presentes nos plasmídeos conjugativos foram amplificados para confirmar a transferência em células receptoras transconjugantes. Extração de DNAPara detectar a transferência de genes de resistência transportados por plasmídeos conjugativos, use o DNA transconjugante como modelo. Use extração simples de preparação de fervura para lisar as paredes celulares bacterianas.NOTA: A extração simples de preparação de fervura é uma abordagem simples para lisar as paredes celulares bacterianas. Esta extração contém DNA plasmidial misturado com DNA genômico, mas como os primers são projetados de acordo com sequências específicas de DNA de interesse, esse modelo também é útil para PCR. Os plasmídeos também podem ser especificamente purificados, embora os rendimentos tendam a cair com o aumento do tamanho do plasmídeo22. Este é um ponto de parada conveniente. O DNA pode ser armazenado por vários meses a -20 °C. PCRDado que o experimento tem um controle negativo e positivo, é benéfico configurar um pool para todas as reações em um tubo de 1,5 mL. Rotule um tubo de 1,5 mL como “pool” e os tubos de PCR necessários com o nome do gene e da amostra (por exemplo, OXA-U1). Pipetar os reagentes de PCR pela seguinte ordem para um tubo de 1,5 ml: água estéril, 2x Master Mix, primers e polimerase (excepto o ADN modelo) (ver Tabela 1). Misture suavemente pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Mantenha-se no gelo o tempo todo.NOTA: Use luvas para evitar contaminar a mistura de reação ou reagentes. Tente evitar a abertura e mistura de reagentes e o manuseio de amostras na mesma área para evitar a contaminação por reagentes. Coloque os reagentes no balde de gelo para suprimir a atividade da nuclease e o priming inespecífico. Deixe-os descongelar completamente antes de estabelecer uma reação. Mantenha os reagentes no gelo durante todo o experimento. Taq Polimerase é adicionada no final porque é sensível a mudanças de pH; ele precisa ser tamponada para evitar degradação ou dobramento incorreto. A sequência dos primers está listada na Tabela 2 – genes de resistência a antibióticos – e na Tabela 3 – replicões 23,24,25,26,27,28. Adicione o DNA modelo ao tubo correspondente. Evite a introdução de bolhas e tampas seguras nos tubos de PCR. Coloque os tubos de PCR no termociclador. Inicie o programa. Consulte as configurações do programa listadas para cada gene na Tabela 2 (genes de resistência) e na Tabela 3 (replicões).NOTA: Defina programas de PCR para manter as amostras a 4 °C após a execução.Condições de PCR para os replicões: um ciclo de desnaturação a 94 °C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 1 min, recozimento a 60 °C durante 30 s, alongamento a 72 °C durante 1 min e uma extensão final de um ciclo a 72 °C durante 5 min.NOTA: Essas são as condições padronizadas por Carattoli et al.29. Quando o programa terminar, armazene os tubos de PCR a 4 °C.NOTA: Este é um ponto de parada conveniente. Os produtos de PCR podem ser armazenados por vários meses a -20 °C Preparar um gel de agarose a 1% pesando 0,6 g de agarose num balão de 250 ml e adicionando 60 ml de 1x tampão Tris-acetato-EDTA (TAE) (ajustar os reagentes se for necessário um tamanho de gel diferente). Derreter a agarose com cuidado e lentamente no micro-ondas para evitar que a agarose se derrame sobre o balão e deixe arrefecer até cerca de 55 °C (10-15 min).Preparar todos os reagentes utilizando água deionizada ultrapura e reagentes de grau analítico: Tampão TAE 50x (base Tris, ácido acético e EDTA) (1 L): Misture 121,1 g de base Tris + 372,24 g de EDTA e adicione 500 mL de água destilada. Dissolva-se com um agitador magnético. Adicione 57,1 mL de ácido acético e adicione água destilada a um volume total de 1.000 mL. Autoclave a 15 psi, 121 °C por 15 min e mantenha à temperatura ambiente até ficar pronto por até 6 meses. Tampão TAE 1x (1 L): Combine 20 mL de tampão TAE 50x com 980 mL de água destilada e misture. Sob um exaustor, adicione 6 μL de SYBR Green à acarose derretida, misture e despeje na bandeja (e pente), previamente selada com fita adesiva para evitar derramamento. Deixe o gel definido por 15-25 min até que a turbidez apareça.NOTA: Outros corantes alternativos também estão disponíveis30,31,32,33. Remova a fita adesiva e coloque o gel na câmara de eletroforese, adicionando 1x tampão TAE suficiente para cobrir o gel. Misture 5 μL de 6x corante de carregamento de gel de DNA com 25 μL de cada reação. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.NOTA: Nem todo o produto de PCR precisa ser carregado no gel para visualizar o produto esperado (ajuste a quantidade de corante conforme correspondente). A amostra de PCR restante pode ser salva e armazenada a -20 °C por vários meses. Carregue a mistura em poços (evite introduzir bolhas) e coloque a tampa da câmara para baixo.NOTA: Carregue a primeira amostra no segundo poço (reserve a primeira para a escada), começando com o controle negativo. Carregue 4 μL de 1 kb de escada de DNA no primeiro poço. Execute a eletroforese a 120 V, 400 mA e 60 min. Visualize o gel sob luz UV (com um iluminador UV) e grave a imagem.NOTA: Se um produto de PCR estiver presente, as bandas de DNA coradas podem ser detectadas usando um transiluminador UV padrão, um transiluminador de luz visível ou um scanner baseado em laser. Reagente Solução de Estoque Volume adicionado à reação de 50 μL (1x) Final Exemplo: volume Exemplo: volume Exemplo: volume adicionado a cada tubo Final Vol. 50 μL Volume adicionado ao controle positivo Volume adicionado ao controle negativo Concentração adicionado a 1x adicionado a 3x (pool) Água estéril – 21,5 μL (q.s. a 50 μL) – 21,5 μL 64,5 μL 49 μL/tubo 49 μL/tubo 49 μL/tubo Master Mix 2x 25 μL 1x 25 μL 75 μL Cartilha para a frente 25 μM 1 μL 0,5 μM 1 μL 3 μL Primer reverso 25 μM 1 μL 0,5 μM 1 μL 3 μL DNA modelo Variável (100–200 ng/μL) Variável (1 μL) Variável 0,5 μL 1,5 μL Polimerase 5 Unidades/μL 0,5 μL 2.5 Unidades – – 1 μL (transconjugante) 1 μL (doador) 1 μL (receptor) NOTA: q.s. é uma abreviatura latina para quantum satis que significa a quantidade que é necessária. Tabela 1: Reagentes de PCR e pool para três reações (um exemplo). Primers (sequência listada na orientação 5′ – 3′) Programa de PCR Tamanho esperado bp) Ref. blaCTX-M grupo 1 94 oC 7 min (864) 23 CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC 94 oC 50 s (35 ciclos) CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC 50 oC 40 s 68 oC 1 min 68 oC 5 min blaCMY-2 95 oC 3 min (1855) 24 anos CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG 95 oC 30 s (30 ciclos) CMY-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC 53 oC 30 s 72 oC 30 s 72 oC 3 min aac(3′)-II 94 oC 5 min (237) 25 aac(3′)-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC 94 oC 30 s (32 ciclos) aac(3′)-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA 60 oC 45 s 72 oC 2 min 72 oC 8 min aadA 94 oC 5 min (283) 26 aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG 94 oC 1 min (35 ciclos) aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG 60 oC 1 min 72 oC 1 min 72 oC 8 min sul-3 94 oC 5 min (799) 27 sul-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG 94 oC 1 min (30 ciclos) sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA 51 oC 1 min 72 oC 1 min 72 oC 5 min tet(A) 95 oC 5 min (957) 28 anos -1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC 95 oC 30 s (23 ciclos) -2: CTGCCTGGACAACATTGCTT 62 oC 30 s 72 oC 45 s 72 oC 7 min dfr Um 95 oC 5 min (302) Esta obra dfrA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG 95 oC 1 min (30 ciclos) 55 oC 1 min DFRA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG 72 oC 1 min 72 oC 7 min catA2 95 oC 5 min catA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTTTC 95 oC 1 min (25 ciclos) (225) Este trabalho catA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT 60 oC 1 min 72 oC 1 min 72 oC 7 min Tabela 2: Primers e programas de PCR utilizados para amplificar genes de resistência diagnóstica. Replicon Primer (sequência listada na orientação 5′ – 3′) Alvo Programa de PCR Tamanho esperado (pb) IncFIB F: TCTGTTTATTCTTTTACTGTCCAC repA 94 oC 5 min 683 R: CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT 94 oC 1 min (30 ciclos) 60 oC 30 s IncFIC F: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG repA2 72 oC 1 min 262 R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT 72 oC 5 min IncI1 F: CGAAAGCCGGACGGCAGAA RNAI 139 R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT Tabela 3: Programa de primers e PCR utilizados para classificar plasmídeos p134797 e p101718 por digitação de replicões baseada em PCR29.

Representative Results

Dado que os doadores SW4955 e SW7037 foram sequenciados, espera-se que essas duas cepas doadoras tenham os fenótipos de resistência correspondentes ao perfil genético de resistência identificado em sua sequência genômica. O plasmídeo p134797 (de SW4955) possui genes que conferem resistência a cefalosporinas de terceira geração (blaCTX-M-55) e resistência a aminoglicosídeos (aac(3)-IIa e aadA1), fenicol (catA2), tetraciclinas (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) e sulfonamidas (sul3); nenhum gene de resistência a antibióticos foi encontrado no cromossomo SW4955. O plasmídeo p101718 (de SW7037) possui apenas um gene de resistência a antibióticos (bla CMY-2), que se espera que confira resistência às cefalosporinas de terceira geração (blaCTX-M-55). Novamente, nenhum gene de resistência a antibióticos foi encontrado no cromossomo SW7037. Após o acasalamento, esperava-se a detecção da transferência dos dois plasmídeos conjugativos com todos os genes de resistência mencionados acima. A detecção de conjugação positiva implica que os receptores identificados como transconjugantes devem ter adquirido os plasmídeos conjugativos. A presença dos genes de resistência diagnóstica para os plasmídeos conjugativos nos transconjugantes (conforme detectado pela PCR) também era esperada. Para ilustrar os métodos aqui descritos, testou-se a capacidade de dois isolados ambientais de E. coli de transferir DNA plasmídico por conjugação. Uma representação esquemática do cenário experimental é mostrada na Figura 1. Dois doadores (E. coli SW4955 e SW7037) e um receptor (E. coli LMB100) foram acasalados de forma independente. O mapa genético dos plasmídeos conjugativos encontrados em E. coli SW4955 (p134797) e SW7037 (p101718) é mostrado na Figura 2. Os plasmídeos conjugativos foram selecionados com carbenicilina e contra-selecionados com rifampicina e estreptomicina, cujos determinantes de resistência estão no cromossomo do receptor. O ágar MacConkey foi utilizado para distinguir os doadores lactose-positivos (que produzem grandes colônias rosas) do receptor e dos transconjugantes (que são lactose negativa e produzem colônias menores e amarelas pálidas) (Figura 3). Figura 3: Ilustração dos marcadores de cor diferenciais para colônias de doadores e receptores no ágar MacConkey. As colônias correspondentes aos doadores são rosa em ágar MacConkey porque são positivas para lactose. Isso distingue as colônias doadoras das receptoras, que são amarelas pálidas e menores (lactose negativa). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A mobilização do plasmídeo conjugativo p134797 foi detectada, com cada um dos cinco antibióticos correspondendo às cinco diferentes classes de genes de resistência encontrados no plasmídeo. Um exemplo de como calcular a eficiência de conjugação (CE) para a cepa SW4955 é apresentado. A partir do ensaio com a cepa SW4955, 172 UFC de transconjugantes foram contadas na placa a partir da diluição 10-2; a contagem do receptor a partir da diluição correspondente (10-2) foi de 10.300.000 UFC/mL (Tabela 4). O CE é calculado da seguinte forma: CE = (174 UFC/mL)/(10.300.000 UFC/mL) EC= 1,67 x 10-5 transconjugantes/receptor LMB100 Transconjugantes da estirpe SW4955 seleccionados com Carbelicilina Eficiência de conjugação Diluição UFC (placa contável) Aprox. UFC/mL UFC (placa contável) 100 Confluente 1,03E+09 10-1 Confluente 1,03E+08 10-2 Confluente 10300000 172 1,67 x 10-5 transconjugantes/receptor 10-3 Confluente 1030000 10-4 Confluente 103000 10-5 Confluente 10300 10-6 Confluente 1030 10-7 103 103 Os valores usados para calcular o CE são realçados em negrito. Tabela 4: Um exemplo de como calcular a eficiência de conjugação (CE) para a cepa SW4955. Os resultados são apresentados na Tabela 5, expressa em eficiência de conjugação por receptor. As cinco eficiências de conjugação obtidas usando a cepa SW4955 como doador estavam todas dentro da mesma ordem de magnitude. Esses resultados indicam que a mobilização do plasmídeo conjugativo pode ser detectada independentemente da seleção utilizada para a identificação do transconjugante. Utilizando a cepa SW7037 como doadora, a eficiência de conjugação obtida foi três ordens de magnitude menor; esses resultados permitem a comparação das eficiências de conjugação de diferentes doadores e tipos de plasmídeos com os mesmos receptores. Eficiência de conjugação Coar Carbenicilina (100 mg/L) Gentamicina (2 mg/L) Cloranfenicol (25 mg/L) Tetraciclina (10 mg/L) Trimetoprim (20 mg/L) SW4955 1,67 x 10-5 5,67 x 10-5 2,17 x 10-5 7,62 x 10-5 1,36 x 10-5 SW7037 2,14 x 10-6 Tabela 5: Eficiências de conjugação das cepas doadoras de E. coli SW4955 e SW7037, dependendo do antibiótico utilizado para seleção. Nos transconjugantes, a presença de replicões e todos os genes de resistência codificados em dois plasmídeos conjugativos testados, e seus correspondentes replicons, foi verificada por PCR. As condições utilizadas para essas reações diagnósticas de PCR são mostradas na Tabela 3. Os géis de diagnóstico são mostrados na Figura 4. Esses géis confirmam a presença dos replicões esperados em transconjugantes (IncFIC e IncFIB em p1347975 e IncI1 em p101718). Eles também confirmam a presença dos genes de resistência a antibióticos esperados, ou seja, o grupo bla CTX-M-55 (beta-lactama), aac(3)-II e aadA (aminoglicosídeo), catA2 (fenicol), tet(A) (tetraciclina), dfrA14 (trimetoprim) e sul3 (sulfonamida) para p1347975 e blaCMY-2 para o p101718 (Figura 4). Figura 4: Géis de eletroforese diagnóstica. Eletroforese em gel de produtos de PCR de genes de resistência a antibióticos e replicões plasmídicos encontrados em plasmídeos conjugativos p134797 e p101718 nas células doadoras (cepas SW4955 e SW7037, respectivamente) e nos transconjugantes LMB100 correspondentes. A carbenicilina foi utilizada para a seleção de plasmídeos. Abreviaturas. -: controle negativo (DNA da cepa LMB100 foi utilizado como controle negativo); D: doador; T: transconjugante. Tamanhos esperados do amplicon: blaCTX-M-55: 864 pb; aac(3)-IIa: 237 pb; aadA1: 283 pb; catA2 : 225 pb; tet(A): 957 pb; dfrA14: 302 pb; sul3: 799 pb; IncFIC(FII): 262 pb; IncFIB: 683 pb; blaCMY-2: 1.855 pb; IncI1-I: 139 pb. O gel tem 1% de agarose. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Os plasmídeos conjugativos fornecem acesso a um conjunto comum de genes dentro de um ambiente particular através da recombinação e transferência horizontal de genes³⁴. Assim, os plasmídeos conjugativos são entidades evolutivas capazes de adquirir e conferir funções que permitem que as bactérias se adaptem a múltiplas condições (incluindo resistência a antibióticos, resistência a metais, aquisição de metais, formação de biofilme e genes patogênicos, entre outros) dentro de uma escala temporal de horas.

Este trabalho apresenta um protocolo para a identificação de plasmídeos conjugativos em bactérias. Para que o protocolo funcione, os marcadores utilizados precisam diferenciar as cepas doadora e receptora, como mostram os controles nas mídias A e B. Eles também precisam selecionar efetivamente as células que carregam o plasmídeo. A reação de acasalamento é crítica. Nessa reação, doadores e receptores precisam fazer contato prolongado (através de pili) para que a conjugação ocorra. Qualquer coisa que possa interromper o contato célula-a-célula, como um tempo de incubação insuficiente ou agitação ou agitação da cultura, diminui assim a eficiência da conjugação. A escolha do receptor também é fundamental, pois algumas cepas receptoras são refratárias à conjugação^35,36. LMB100 é proposto como o receptor de escolha, pois é capaz de tomar plasmídeos de vários tipos de incompatibilidade.

A taxa de conjugação é específica para cada par de cromossomos plasmídeo-doador, receptor e condição ambiental. A conjugação de plasmídeos específicos mostrou-se sensível a um grande número de variáveis, incluindo fase de crescimento, densidade celular, relação doador-receptor, se a conjugação é conduzida em meio líquido ou sólido, carbono, oxigênio, sais biliares, concentrações de metais, presença de células de mamíferos, temperatura, pH e tempo de acasalamento^13,14,15 . O estudo dessas interações depende da detecção inicial de um plasmídeo conjugativo a ser estudado em profundidade. Assim, o protocolo aqui descrito também pode ser modificado para explorar o impacto de diferentes variáveis experimentais, embora isso venha ao custo de restringir o número de doadores triados. Também pode identificar plasmídeos mobilizáveis em hospedeiros que possuem plasmídeos auxiliares (ou seja, plasmídeos que permitem a conjugação, fornecendo funções ausentes dos plasmídeos mobilizáveis em trans⁶).

Conhecer a sequência do plasmídeo conjugativo é recomendado (mas não é necessário para detectar a conjugação, como discutido acima). Quando os doadores são lactose-negativos (produzindo colônias amarelas no ágar MacConkey), um receptor positivo para lactose (produzindo colônias rosa no ágar MacConkey) pode ser usado para distinguir transconjugantes verdadeiros de células doadoras que são capazes de crescer no meio para selecionar transconjugantes. O protocolo aqui descrito é projetado para detectar plasmídeos conjugativos de membros ambientais, comensais e patogênicos da família Enterobacteriaceae; no entanto, pode ser usado com qualquer espécie bacteriana com um doador, receptor, antibiótico(s) e marcadores de cor adequados. A identificação desses componentes críticos em outras bactérias requer estudos sistemáticos usando múltiplos doadores, receptores e marcadores (antibióticos e cores). Este protocolo não foi testado em bactérias Gram-positivas.

Diversas variantes do método aqui apresentado têm sido relatadas na literatura, recentemente revisadas²⁰. O resultado qualitativo também pode ser referido de diferentes maneiras (por exemplo, frequência de exconjugantes e frequência de transferência de genes), e unidades adimensionais podem ser usadas para relatar a eficiência da conjugação (mL/UFC x h)²⁰.

O protocolo aqui descrito resolve diversas limitações anteriormente não abordadas pelos métodos existentes^16,18,19,20. Em primeiro lugar, foi identificado um destinatário adequado. Em segundo lugar, o uso de dois antibióticos (rifampicina e estreptomicina) para selecionar transconjugantes verdadeiros minimiza a possibilidade de que os doadores desenvolvam resistência a um dos antibióticos utilizados para selecionar transconjugantes através da mutagênese espontânea. Os falsos transconjugantes também podem resultar da proteção do espectador pela hidrólise do antibiótico usado para selecionar transconjugantes por enzimas (por exemplo, beta-lactamases) produzidas em grandes quantidades pelo doador. Em terceiro lugar, vários controles experimentais são incluídos para garantir que o produto do acasalamento seja um verdadeiro transconjugante (ou seja, uma célula receptora que incorporou de forma estável o plasmídeo conjugativo do doador). Aqui, apresentamos dois métodos independentes para testar a autenticidade dos transconjugantes, a saber, um marcador colorimétrico no ágar MacConkey e a detecção por PCR dos replicões e genes de resistência a antibióticos do plasmídeo conjugativo no receptor. Além disso, o protocolo descrito aqui é projetado para isolar e caracterizar plasmídeos conjugativos de membros ambientais, commentais e patogênicos da família Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella e outras espécies).

Para entender a mecânica da conjugação, observações experimentais foram modeladas usando simulações de computador. Esses modelos preditivos estimam a frequência de transferência de plasmídeos para determinadas densidades de crescimento de doadores, receptores e transconjugantes. Um modelo conhecido como modelo de desfecho encontrou limiares acima dos quais a taxa de transferência de plasmídeos em cultura líquida e concluiu que a taxa de transferência não é afetada pela densidade celular, razão doador:receptor e tempo de acasalamento¹⁹. A hibridização in situ por fluorescência (FISH) tem sido utilizada como método alternativo de detecção de plasmídeos transconjugantes. O FISH permite a visualização plasmídica usando microscopia de fluorescência através da hibridização de uma sonda de DNA e um DNA alvo. Assim, o FISH permite a detecção visual de fluxos plasmídicos em diferentes populações celulares³⁷, embora não tenha o mesmo nível de sensibilidade que o método aqui apresentado se os transconjugantes forem detectados por triagem visual em oposição à seleção.

Há uma enorme necessidade de entender a biologia dos plasmídeos conjugativos que estão dispersando genes de resistência a antibióticos através de diferentes componentes do ecossistema (clínica, agricultura, esgoto, vida selvagem, animais domésticos, solos, rios e lagos). Em suma, as condições experimentais simplificadas apresentadas nos protocolos aqui descritos facilitam o rastreamento de doadores em escala e, portanto, representam uma ferramenta fundamental para o estudo da transferência horizontal de genes originados em plasmídeos conjugativos de uma variedade de fontes. Eles podem ser usados para investigar a prevalência de genes de resistência a antibióticos ou outros genes clinicamente relevantes em plasmídeos conjugativos de múltiplas fontes e bactérias. Eles também podem ser adaptados para o estudo da conjugação in vivo (por exemplo, no intestino de vertebrados) e para estudar as condições que modulam a eficiência da conjugação. Todos esses estudos contribuirão muito para a compreensão de como a mobilização de plasmídeos conjugativos multirresistentes contribui para a disseminação da resistência a múltiplas drogas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

LM-B, IMG, AT e IS foram apoiados pela subvenção do NIH GM055246 concedida à LM-B. O GC-C foi premiado com a Bolsa de Pós-Doutorado UC MEXUS-CONACYT por dois anos consecutivos: AY 2017-18 e 2018-19. Agradecemos imensamente aos alunos Sage Chavez e Pepper St. Clair, do programa de orientação da Rede de Inspiração Acadêmica (GAIN) patrocinado pela Genentech-Foundation por seu apoio técnico em experimentos.

Materials

1.5 mL tube racks	Thermo Fisher Scientific	22-313630	It can be replaced for another brand
2.0 mL Cryogenic vials	Corning	430659	It can be replaced for another brand
14 mL conical tubes	FALCON	149597	It can be replaced for another brand
14 mL tube racks	Thermo Fisher Scientific	8850	It can be replaced for another brand
1 kb DNA ladder	New England Biolabs	N0552G
250 mL sterile flasks	PYREX	5320	It can be replaced for another permanent marker brand
Acetic acid	Fisher Scientific	A38SI-212	It can be replaced for another brand
Agarose (molecular biology grade, multipurpose)	Fisher Scientific	BP160-500	It can be replaced for another brand
Carbenicillin	GOLD BIOTECHNOLOGY	C-103-50	It can be replaced for another brand
Disposable inoculating loops: 1 µL	Fisherbrand	22-363-595	It can be replaced for another brand
DNA gel loading dye 6x	New England Biolabs	B7024S	It can be replaced for another brand
EDTA	Fisher Scientific	BP119-500	It can be replaced for another brand
Electronic digital scale	Denver Instrument	APX-2001	It can be replaced for another brand
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL	Eppendorf	14-282-302	It can be replaced for another brand
Equipment for agarose gel electrophoresis	Fisher Scientific	FP300	It can be replaced for another brand
Ethanol-resistant markers	Sharpie	37001; 37002; 37003	It can be replaced for another brand
Gel documentation systems (UVP GelSolo)	Analytakjena	SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01	It can be replaced for another brand
Gloves	X-GEN	44-100M	Any nitrile gloves brand works
Ice bucket	Thermo Fisher Scientific	432128	It can be replaced for another brand
MacConkey agar	BD DIFCO	212123
Master Mix	BioLabs	M0496S	It can be replaced for another brand
Methanol	Fisher Scientific	A452-4	It can be replaced for another brand
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL	Fisherbrand	05-408-138	It can be replaced for another brand
Mueller Hinton agar	BD DIFCO	DF0479-17-3
Mueller Hinton broth	BD DIFCO	275730
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA	Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL	740588. 250
PCR tube racks	AXYGEN	R96PCRFSP	It can be replaced for another brand
PCR tubes (0.2 mL)	AXYGEN	PCR-02-C	It can be replaced for another brand
Rifampicin	Fisher Scientific	50-164-7517
Set of micropipettes that dispense between 1 – 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000)	RAININ	17008648; 17008650; 17008652; 17008653	Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand
Sodium chloride	Fisher Scientific	S671-3	It can be replaced for another brand
Spectrophotometer	Thermo Scientific	335905P	It can be replaced for another brand
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL	Eclipse	1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9	It can be replaced for another brand
Streptomycin	Fisher Scientific	BP910-50
SYBR Safe DNA gel stain	Thermo Fisher Scientific	S33102
Taq DNA Polymerase	BioLabs	M0273S
Thermal cycler C1000 Touch	Bio-Rad	1851196	It can be replaced for another brand
Tris	Fisher Scientific	BP153-500	It can be replaced for another brand

References

Lederberg, J., Tatum, E. Gene recombination in Escherichia coli. Nature. 158 (4016), 558 (1946).
de la Cruz, F., Frost, L. S., Meyer, R. J., Zechner, E. L. Conjugative DNA metabolism in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (1), 18-40 (2010).
Grohmann, E., Muth, G., Espinosa, M. Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (2), 277-301 (2003).
Koraimann, G., Wagner, M. A. Social behavior and decision making in bacterial conjugation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 54 (2014).
Dziewit, L., et al. Diversity and role of plasmids in adaptation of bacteria inhabiting the Lubin copper mine in Poland, an environment rich in heavy metals. Frontiers in Microbiology. 6, 152 (2015).
Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
Balbuena-Alonso, M. G., et al. Genomic analysis of plasmid content in food isolates of E. coli strongly supports its role as a reservoir for the horizontal transfer of virulence and antibiotic resistance genes. Plasmid. 123-124, 102650 (2022).
San Millan, A., MacLean, R. C. Fitness costs of plasmids: A limit to plasmid transmission. Microbiol Spectrum. 5 (5), (2017).
Coluzzi, C., Garcillán-Barcia, M. P., de la Cruz, F., Rocha, E. P. C. Evolution of plasmid mobility: Origin and fate of conjugative and nonconjugative plasmids. Molecular Biology and Evolution. 39 (6), 1-23 (2022).
Bevan, E. R., et al. Molecular characterization of plasmids encoding blaCTX-M from faecal Escherichia coli in travellers returning to the UK from South Asia. The Journal of Hospital Infection. 114, 134-143 (2021).
Minja, C. A., Shirima, G., Mshana, S. E. Conjugative plasmids disseminating CTX-M-15 among human, animals and the environment in Mwanza Tanzania: a need to intensify one health approach. Antibiotics. 10 (7), 836 (2021).
Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. International Journal of Medical Microbiology. 303 (6-7), 298-304 (2013).
Sengupta, M., Austin, S. Prevalence and significance of plasmid maintenance functions in the virulence plasmids of pathogenic bacteria. Infection and Immunity. 79 (7), 2502-2509 (2011).
Alderliesten, J. B., et al. Effect of donor-recipient relatedness on the plasmid conjugation frequency: a meta-analysis. BMC Microbiology. 20 (1), 135 (2020).
Neil, K., Allard, N., Rodrigue, S. Molecular mechanisms influencing bacterial conjugation in the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 12, 673260 (2021).
Liu, G., Bogaj, K., Bortolaia, V., Olsen, J. E., Thomsen, L. E. Antibiotic-induced, increased conjugative transfer is common to diverse naturally occurring ESBL plasmids in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 2119 (2019).
Suchman, E. Polymerase chain reaction protocol. American Society for Microbiology. , 1-14 (2011).
Watanabe, T. Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria. Bacteriological Reviews. 27 (1), 87-115 (1963).
Simonsen, L., Gordon, D. M., Stewart, F. M., Levin, B. R. Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method. Journal of General Microbiology. 136 (11), 2319-2325 (1990).
Huisman, J. S., et al. Estimating plasmid conjugation rates: A new computational tool and a critical comparison of methods. Plasmid. 121, 102627 (2022).
Jung, B., Hoilat, G. J. MacConkey medium. StatPearls. , (2022).
. NucleoSpin Plasmid DNA purification Available from: https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf (2022)
Jiang, X., et al. Detection of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9), 2990-2995 (2006).
Stapleton, P. D., Shannon, K. P., French, G. L. Carbapenem resistance in Escherichia coli associated with plasmid-determined CMY-4 beta-lactamase production and loss of an outer membrane protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (5), 1206-1210 (1999).
Ben Yahia, H., et al. Detection of CTX-M-15 harboring Escherichia coli isolated from wild birds in Tunisia. BMC Microbiology. 18 (1), 26 (2018).
Madsen, L., Aarestrup, F. M., Olsen, J. E. Characterisation of streptomycin resistance determinants in Danish isolates of Salmonella Typhimurium. Veterinary Microbiology. 75 (1), 73-82 (2000).
Perreten, V., Boerlin, P. A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (3), 1169-1172 (2003).
Guardabassi, L., Dijkshoorn, L., Collard, J. M., Olsen, J. E., Dalsgaard, A. Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains. Journal of Medical Microbiology. 49 (10), 929-936 (2000).
Carattoli, A., et al. Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. Journal of Microbiological Methods. 63 (3), 219-228 (2005).
Green, M. R., Sambrook, J. Agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor protocols. 2019 (1), (2019).
Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutation Research. 439 (1), 37-47 (1999).
Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators. Analytical Biochemistry. 268 (2), 278-288 (1999).
Oatey, P. Imaging fluorescently stained DNA with CCD technology How to increase sensitivity and reduce integration times. Biotechniques. 42 (3), 376-377 (2007).
Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Conjugative plasmids: vessels of the communal gene pool. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 364 (1527), 2275-2289 (2009).
Du, L., Liu, R. H., Ying, L., Zhao, G. R. An efficient intergeneric conjugation of DNA from Escherichia coli to mycelia of the lincomycin-producer Streptomyces lincolnensis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 4797-4806 (2012).
Kirk, J. A., Fagan, R. P. Heat shock increases conjugation efficiency in Clostridium difficile. Anaerobe. 42, 1-5 (2016).
Esteves, G. M., Pereira, J. A., Azevedo, N. F., Azevedo, A. S., Mendes, L. Friends with benefits: An inside look of periodontal microbes’ interactions using fluorescence in situ hybridization-Scoping review. Microorganisms. 9 (7), 1504 (2021).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Mota-Bravo, L., Camps, M., Muñoz-Gutiérrez, I., Tatarenkov, A., Warner, C., Suarez, I., Cortés-Cortés, G. Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli. J. Vis. Exp. (193), e64523, doi:10.3791/64523 (2023).

Automatically Generated