Die Konjugation vermittelt den horizontalen Gentransfer, indem sie Plasmid-DNA über zwei verschiedene Zellen mobilisiert und so die Verbreitung nützlicher Gene erleichtert. Diese Arbeit beschreibt eine weit verbreitete Methode zur effizienten Detektion des konjugativen Plasmidtransfers, die auf der Verwendung von Differentialmarkern im konjugativen Plasmid, Spender und Empfänger basiert, um die Transkonjugation zu erkennen.
Die Konjugation stellt einen der Hauptmechanismen dar, die den horizontalen Gentransfer in gramnegativen Bakterien erleichtern. Diese Arbeit beschreibt Methoden zur Untersuchung der Mobilisierung von natürlich vorkommenden konjugativen Plasmiden am Beispiel zweier natürlich vorkommender Plasmide. Diese Protokolle beruhen auf dem differentiellen Vorhandensein von selektierbaren Markern in Spender-, Empfänger- und konjugativem Plasmid. Konkret umfassen die beschriebenen Methoden 1) die Identifizierung natürlicher konjugativer Plasmide, 2) die Quantifizierung der Konjugationsraten in Festkultur und 3) den diagnostischen Nachweis der Antibiotikaresistenzgene und Plasmidreplicon-Typen in transkonjuganten Empfängern durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die hier beschriebenen Protokolle wurden im Zusammenhang mit der Untersuchung der Evolutionsökologie des horizontalen Gentransfers entwickelt, um das Vorhandensein von konjugativen Plasmiden, die Antibiotikaresistenzgene tragen, in Bakterien in der Umwelt zu untersuchen. Der in diesen Kulturexperimenten beobachtete effiziente Transfer von konjugativen Plasmiden unterstreicht die biologische Relevanz der Konjugation als Mechanismus, der den horizontalen Gentransfer im Allgemeinen und die Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen im Besonderen fördert.
Im Jahr 1946 beschrieben Lederberg und Tatum1 einen sexuellen Prozess in Escherichia coli K-12, der heute als Konjugation bekannt ist. Bakterielle Konjugation ist der Prozess, bei dem eine Bakterienzelle (der Spender) unidirektional genetisches Material durch direkten Zell-zu-Zell-Kontakt auf eine andere Zelle (den Empfänger) überträgt. Die Konjugation ist in Bakterien2,3 weit verbreitet, obwohl der Anteil der Spenderzellen, die die Konjugationsmaschinerie exprimieren, typischerweise sehr klein ist4.
Plasmide sind autonom replizierende extrachromosomale DNA-Elemente. Zusätzlich zu den Genen, die an der Replikation und Aufrechterhaltung von Plasmiden beteiligt sind, tragen Plasmide häufig eine Vielzahl von Genen, die an der Anpassung an Umweltprobleme wie Schwermetalle oder die Exposition gegenüber Antibiotika beteiligt sind5. Konjugative Plasmide sind eine Klasse von Plasmiden mit einer Reihe spezialisierter Gene, die ihre Übertragung auf Empfängerzellen ermöglichen und ihre Persistenz nach der Übertragung unterstützen6. Konjugative Plasmide variieren in der Größe von 21,8 kb bis 1,35 Mb in Bakterien im Stamm Pseudomonadota (gleichbedeutend mit Proteobakterien), wobei der Median um 100 kb 5,7 liegt. Sie haben in der Regel auch eine niedrige Kopienzahl, möglicherweise um die metabolische Belastung des Wirts niedrig zu halten 8,9.
Der typische konjugative Apparat besteht aus vier Komponenten: einem Transferursprung (oriT), einer Relaxase, einem Typ-IV-Kopplungsprotein und einem Typ-IV-Sekretionssystem (eine röhrenartige Struktur namens Pilus, die es den Spendern ermöglicht, mit den Empfängern in Kontakt zu treten)6. Nur ein sehr kleiner Teil der Zellen, die konjugative Plasmide tragen, exprimieren die Konjugationsmaschinerie4, aber wenn die Plasmide einen Fitnessvorteil bieten, können sich die Transkonjuganten schnell in der Population ausbreiten. Zwischen 35% und über 80% der E. coli-Isolate, die aus verschiedenen Lebensräumen gesammelt wurden, haben konjugative Plasmide mit Genen, die Resistenz gegen mindestens ein Antibiotikum verleihen10,11; Daher ist der horizontale Gentransfer, der durch konjugative Plasmide vermittelt wird, ein wichtiger Mechanismus, der die globale Ausbreitung von Antibiotikaresistenzgenen antreibt12.
In Laborkultur durchgeführte Paarungsexperimente haben gezeigt, dass die Konjugationshäufigkeit von mehreren Faktoren beeinflusst wird, einschließlich der Art der Empfängerzellen, der Wachstumsphase, der Zelldichte, des Spender-Empfänger-Verhältnisses, ob die Konjugation in flüssigen oder festen Medien durchgeführt wird, Kohlenstoff, Sauerstoff, Gallensalzen, Metallkonzentrationen, Vorhandensein von Säugetierzellen, Temperatur, pH-Wert und Paarungszeit13,14, 15. Sonstiges
Diese Arbeit beschreibt Protokolle zum Nachweis des Vorhandenseins von konjugativen Plasmiden in einem bestimmten Wirtsstamm, zur Quantifizierung der Konjugationsraten in fester Kultur und zur Überprüfung ihrer Übertragung auf Empfängerzellen. Diese Protokolle können als erster Schritt zur Identifizierung natürlicher konjugativer Plasmide verwendet werden, die für die Forschung geeignet sind. Sie verwenden eine minimale Anzahl vereinfachter Schritte, da sie darauf ausgelegt sind, das Vorhandensein konjugativer Plasmide in Bakterien zu untersuchen, die aus mehreren Quellen (Umwelt, kommensal und pathogen) in großem Maßstab (Dutzende bis Hunderte von Spendern) stammen.
Darüber hinaus werden Tests gezeigt, um nachzuweisen, ob die Mobilisierung eines bestimmten konjugativen Plasmids unabhängig von dem für den Nachweis verwendeten Antibiotikum ist (d.h. die Relevanz des Antibiotikaresistenzgens unter Selektion) und um die Konjugationsraten zweier konjugativer Plasmide in verschiedenen Umweltisolaten zu vergleichen.
Basierend auf der genetischen Zusammensetzung der relevanten konjugativen Plasmide (Plasmidreplikon und Antibiotikaresistenzgen-Make-up) kann jeder Schritt des Protokolls modifiziert werden, um die Auswirkungen einer Vielzahl von Faktoren zu untersuchen, die die Konjugationsrate beeinflussen können.
Allgemeines Versuchsdesign:
Die wesentlichen Komponenten, die für den Aufbau eines Paarungsexperiments benötigt werden, sind Spenderzellen, ein Empfängerstamm und feste Medien zur Auswahl von Spendern (Antibiotikum A), Empfängern (Antibiotikum B) und Transkonjuganten (Antibiotikum A und B). Transkonjuganten sind Empfängerzellen, die das konjugative Plasmid des Spenders stabil halten.
Spenderzellen sind resistent gegen ein Antibiotikum (Antibiotikum A) und anfällig für den Marker oder die Marker, die zur Auswahl der Empfängerzellen verwendet werden (Antibiotikum B). Die genomische Lokalisation des Antibiotikaresistenzgens (d.h. ob es sich im Chromosom oder in einem Plasmid der Spenderzelle befindet) muss nicht a priori bekannt sein, da die Mobilisierung von Antibiotikaresistenzmarkern für den Empfänger (nach einem direkten Spender-Empfänger-Kontakt) impliziert, dass sich die vom Spender bereitgestellten Marker in einem Plasmid befanden.
Ein Empfängerstamm (von dem bekannt ist, dass er konjugative Plasmide einnimmt) muss einen stabilen selektierbaren Marker haben, der im Spender nicht vorhanden ist. Dieser wählbare Marker ist im Allgemeinen resistent gegen ein Antibiotikum oder Biozid, das sich im Chromosom befindet. Die Auswahl des Empfängers, der in Paarungsexperimenten verwendet werden soll, ist von entscheidender Bedeutung, da einige E. coli-Stämme in ihrer Fähigkeit, konjugative Plasmide aufzunehmen, variieren16.
Sobald diese Komponenten etabliert sind, ist jede Kolonie, die nach einem Spender-Empfänger-Paarkontakt auf Medien mit beiden Antibiotika (A und B) wächst, ein mutmaßlicher Transkonjugant (Abbildung 1). Dies setzt voraus, dass Spender in Medien mit Antibiotikum A wachsen können, aber nicht in Medien mit Antibiotikum B, und dass Empfänger in der Lage sind, in Medien mit Antibiotikum B zu wachsen, aber nicht in der Lage, mit Antibiotikum A zu wachsen. Der erste Test besteht aus dem Nachweis (durch Polymerase-Kettenreaktion [PCR], Amplifikation von Genen oder anderen Methoden) von Genen, die im konjugativen Plasmid in transkonjuganten Kolonien gefunden wurden. Der zweite Test beinhaltet die Verwendung von differentiellen Koloniefarbmarkern basierend auf dem Laktosestoffwechsel. Die unterschiedliche Koloniefarbe wird durch die Verwendung von MacConkey-Agar aufgedeckt; Die Laktose im Agar kann von Laktose-fermentierenden (LAC+) Mikroorganismen als Fermentationsquelle genutzt werden. Diese Mikroorganismen produzieren organische Säuren, insbesondere Milchsäure, die den pH-Wert senken. Neutrales Rot ist ein im Medium enthaltener pH-Indikator, der sich von cremefarben zu leuchtend rot/rosa verfärbt, wenn der pH-Wert unter 6,817 fällt. So produzieren E . coli-Laktose-positive Stämme größere rosa Kolonien auf MacConkey-Agar, während Laktose-negative Stämme blassgelbe und kleinere Kolonien auf MacConkey-Agar produzieren.
Abbildung 1: Experimentelles Design zum Nachweis des Vorhandenseins konjugativer Plasmide in Spenderstämmen. In diesem Beispiel trägt der Spender ein konjugatives Plasmid mit einem Antibiotikaresistenzgen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum A verleiht, aber er ist anfällig für das Antibiotikum B. Umgekehrt hat der Empfänger eine chromosomale Resistenzdeterminante, die Schutz vor dem Antibiotikum B bietet, aber es ist anfällig für das Antibiotikum A. Transkonjuganten sind gegen beide Antibiotika (A und B) resistent. weil sie das konjugative Plasmid des Spenders haben, das Resistenz gegen das Antibiotikum A verleiht, und das Chromosom des Empfängers, das Schutz vor dem Antibiotikum B bietet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Konjugationsrate für ein Spender-Empfänger-Paar (unter gegebenen experimentellen Bedingungen) kann berechnet werden, indem die Anzahl der Transkonjuganten durch die Anzahl der Spender oder durch die Anzahl der Empfänger dividiert wird. Die erste Rate gibt den Anteil der Spenderzellen an, die eine funktionelle Expression der Konjugationsmaschinerie durch den Spender aufweisen16,18, während die zweite Rate die Fähigkeit des Empfängers angibt, konjugative Plasmide 19,20 zu nehmen. In dieser Studie stellt die Konjugationsrate, sofern nicht anders angegeben, den Anteil der Empfängerzellen dar, die transkonjugant werden (d.h. Rate pro Empfänger).
Hier werden zwei unabhängige Paarungsexperimente berichtet, an denen ein E. coli-Empfänger und zwei E. coli-Spender beteiligt waren. Darüber hinaus wurden verschiedene Antibiotika verwendet, um Transkonjuganten für einen der Spender auszuwählen, um zu bestätigen, dass ein einzelnes multiresistentes Plasmid mit jedem der im konjugativen Plasmid gefundenen Antibiotikaresistenzgene ausgewählt werden kann.
Die in dieser Arbeit verwendeten Spender- und Empfängerstämme wurden vollständig sequenziert, um alle Komponenten dieses experimentellen Systems zu verstehen. Diese Protokolle wurden jedoch entwickelt, um nach dem Vorhandensein von konjugativen Plasmiden in Wirten unbekannter Sequenz zu suchen, und können auch in diesem experimentellen Kontext verwendet werden. In diesem Fall werden jedoch zuerst die relevanten Gene sequenziert.
Die im Protokoll verwendeten Spender- und Empfängerstämme sind die folgenden:
Spender 1. E. coli SW4955 wurde in einem See in Baton Rouge (LA, USA) gesammelt. Es hat ein konjugatives Plasmid mit 134.797 bp (p134797) mit IncFIC(FII) und IncFIB (AP001918) Replikons. Dieses konjugative Plasmid verfügt über Gene, die Resistenz gegen Cephalosporine der dritten Generation (blaCTX-M-55), Aminoglykoside (aac(3)-IIa und aadA1), Phänicole (catA2), Tetracycline (tet(A)), Trimethoprim (dfrA14) und Sulfonamide (sul3) verleihen. Eine vollständige Karte von p134797 finden Sie in Abbildung 2A. E. coli SW4955 ist Laktose-positiv und produziert rosa Kolonien auf MacConkey-Agar.
Spender 2. E. coli SW7037 wurde im Eriesee (Ottawa County, OH, USA) gesammelt. Es trägt ein konjugatives Plasmid (p101718) mit 101.718 bp und einem IncI1-I(Alpha)-Replikon. Dieses konjugative Plasmid hat ein Gen, das Resistenz gegen Beta-Lactame verleiht (blaCMY-2). Eine vollständige Karte von p101718 finden Sie in Abbildung 2B. E. coli SW7037 ist auch Laktose-positiv und produziert rosa Kolonien auf MacConkey-Agar.
Abbildung 2: Genetische Karte der in dieser Studie verwendeten konjugativen Plasmide . (A) Plasmid p134797, das konjugative Plasmid, das im E. coli-Stamm SW4955 gefunden wurde. (B) Plasmid p101718, das konjugative Plasmid, das im E. coli-Stamm SW7037 gefunden wird. Antibiotikaresistenzgene sind blau und Gene, die zum Konjugationsapparat gehören, rot hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Empfänger. E. coli Als Empfänger wird LMB100 verwendet. Dies ist ein plasmidloser Stamm, der gegen Rifampicin (100 mg/L) und Streptomycin (100 mg/L) resistent ist. Eine Resistenz gegen zwei Antibiotika verringert die Wahrscheinlichkeit, dass beim Spender Resistenzmutationen auftreten, die die Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen würden. Darüber hinaus ist E. coli LMB100 laktosenegativ und kann von den beiden Spenderstämmen unterschieden werden, da es hellgelbe und kleine Kolonien (im Gegensatz zu größeren, rosa Kolonien) auf MacConkey-Agar produziert.
Wenn der Spender laktosenegativ ist, empfehlen wir die Verwendung eines laktosepositiven Empfängers (z. B . E. coli J53). Die LMB100- und J53-Stämme stehen anderen Laboren zur Verwendung zur Verfügung. Bitte senden Sie eine Anfrage an Dr. Gerardo Cortés-Cortés mit einer Adresse und einer FedEx-Nummer.
Das feste Medium, das zur Auswahl und Zählung von Spendern, Empfängern und Transkonjuganten benötigt wird, ist MacConkey-Agar in Petrischalen mit einem Durchmesser von 100 mm. Die Zugabe der folgenden Antibiotika ist erforderlich: (i) Medium A: Carbenicillin (100 mg/l), um die Spender zu zählen und sicherzustellen, dass die Empfänger mit diesem Antibiotikum nicht wachsen können. (ii) Medien B: Rifampicin (100 mg/l) + Streptomycin (100 mg/l), um die Empfänger zu zählen und sicherzustellen, dass die Spender diese beiden Antibiotika nicht züchten können. iii) Medien AB: Carbenicillin (100 mg/l) + Rifampicin (100 mg/l) + Streptomycin (100 mg/l) zur Gewinnung und Zählung von Transkonjutanten. (iv) Medium C: keine Antibiotika, um alle untersuchten Isolate zu streifen.
Die Konjugationsraten von konjugativen Plasmiden von E. coli SW4955 und E. coli SW7037 bis E. coli LMB100 werden verglichen. Darüber hinaus wird im Fall des konjugativen Plasmids p134797 (SW4955-Stamm) das Antibiotikum Carbenicillin (100 mg/l) in nachfolgenden Experimenten durch Gentamicin (2 mg/l), Chloramphenicol (25 mg/l), Tetracyclin (10 mg/l), Trimethoprim (20 mg/l) oder Sulfamethoxazol (100 mg/l) ersetzt, um festzustellen, ob der für die Selektion verwendete Antibiotikaresistenzmarker einen Einfluss auf die Ergebnisse hat.
Konjugative Plasmide bieten durch Rekombination und horizontalen Gentransfer Zugang zu einem gemeinschaftlichen Pool von Genen innerhalb einer bestimmten Umgebung34. Somit sind konjugative Plasmide evolutionäre Einheiten, die in der Lage sind, Funktionen zu erwerben und zu übertragen, die es Bakterien ermöglichen, sich innerhalb einer zeitlichen Skala von Stunden an mehrere Bedingungen anzupassen (einschließlich Resistenz gegen Antibiotika, Resistenz gegen Metalle, Erwerb von Metallen, Biofilmbildung und pathogene Gene).
Diese Arbeit stellt ein Protokoll zur Identifizierung von konjugativen Plasmiden in Bakterien vor. Damit das Protokoll funktioniert, müssen die verwendeten Marker zwischen Spender- und Empfängerstämmen unterscheiden, wie die Kontrollen in den Medien A und B zeigen. Sie müssen auch effektiv Zellen auswählen, die das Plasmid tragen. Die Paarungsreaktion ist entscheidend. Bei dieser Reaktion müssen Spender und Empfänger einen längeren Kontakt (über Pili) herstellen, damit eine Konjugation stattfinden kann. Alles, was den Zell-zu-Zell-Kontakt stören kann, wie z. B. eine unzureichende Inkubationszeit oder das Schütteln oder Rühren der Kultur, verringert somit die Effizienz der Konjugation. Die Wahl des Empfängers ist ebenfalls entscheidend, da einige Empfängerstämme gegenüber der Konjugation refraktärsind 35,36. LMB100 wird als Empfänger der Wahl vorgeschlagen, da es in der Lage ist, Plasmide mehrerer Inkompatibilitätstypen aufzunehmen.
Die Konjugationsrate ist spezifisch für jedes Plasmid-Donor-Chromosomenpaar, jeden Empfänger und jede Umgebungsbedingung. Es wurde festgestellt, dass die Konjugation spezifischer Plasmide empfindlich auf eine Vielzahl von Variablen reagiert, darunter Wachstumsphase, Zelldichte, Spender-zu-Empfänger-Verhältnis, ob die Konjugation in flüssigen oder festen Medien durchgeführt wird, Kohlenstoff, Sauerstoff, Gallensalze, Metallkonzentrationen, Vorhandensein von Säugetierzellen, Temperatur, pH-Wert und Paarungszeit13,14,15 . Die Untersuchung dieser Wechselwirkungen hängt von der anfänglichen Detektion eines konjugativen Plasmids ab, das eingehend untersucht werden soll. Daher kann das hier beschriebene Protokoll auch modifiziert werden, um die Auswirkungen verschiedener experimenteller Variablen zu untersuchen, obwohl dies auf Kosten der Begrenzung der Anzahl der gescreenten Spender geht. Es kann auch mobilisierbare Plasmide in Wirten identifizieren, die über Helferplasmide verfügen (d.h. Plasmide, die die Konjugation ermöglichen, indem sie Funktionen bereitstellen, die in den mobilisierbaren Plasmiden in trans6 fehlen).
Es wird empfohlen, die Sequenz des konjugativen Plasmids zu kennen (aber nicht notwendig, um die Konjugation zu erkennen, wie oben diskutiert). Wenn die Spender laktosenegativ sind (gelbe Kolonien auf MacConkey-Agar produzieren), kann ein laktosepositiver Empfänger (der rosa Kolonien auf MacConkey-Agar produziert) verwendet werden, um echte Transkonjuganten von Spenderzellen zu unterscheiden, die in der Lage sind, auf dem Medium zu wachsen, um Transkonjuganten auszuwählen. Das hier beschriebene Protokoll dient zum Nachweis konjugativer Plasmide von umweltbedingten, kommensalen und pathogenen Mitgliedern der Familie Enterobacteriaceae; Es kann jedoch mit jeder Bakterienart mit einem geeigneten Spender, Empfänger, Antibiotikum und Farbmarkern verwendet werden. Die Identifizierung dieser kritischen Komponenten in anderen Bakterien erfordert systematische Studien mit mehreren Spendern, Empfängern und Markern (Antibiotika und Farbstoffe). Dieses Protokoll wurde nicht an grampositiven Bakterien getestet.
In der Literatur wurden mehrere Varianten der hier vorgestellten Methode beschrieben, die kürzlich überprüftwurden 20. Das qualitative Ergebnis kann auch auf unterschiedliche Weise bezeichnet werden (z. B. exkonjugante Häufigkeit und Gentransferfrequenz), und dimensionslose Einheiten können verwendet werden, um die Konjugationseffizienz (ml/KBE x h) zu melden20.
Das hier beschriebene Protokoll löst mehrere Einschränkungen, die bisher durch die bestehenden Methoden16,18,19,20 nicht behoben wurden. Zunächst wurde ein geeigneter Empfänger identifiziert. Zweitens minimiert die Verwendung von zwei Antibiotika (Rifampicin und Streptomycin) zur Selektion echter Transkonjuganten die Wahrscheinlichkeit, dass Spender eine Resistenz gegen eines der Antibiotika entwickeln, die zur Selektion von Transkonjuganten durch spontane Mutagenese verwendet werden. Falsche Transkonjuganten können auch durch den Schutz von Umstehenden durch Hydrolyse des Antibiotikums entstehen, das zur Selektion von Transkonjuganten durch Enzyme (z. B. Beta-Lactamasen) verwendet wird, die vom Spender in großen Mengen produziert werden. Drittens werden mehrere experimentelle Kontrollen einbezogen, um sicherzustellen, dass das Produkt der Paarung ein echter Transkonjugant ist (d.h. eine Empfängerzelle, die das konjugative Plasmid des Spenders stabil eingebaut hat). Hier stellten wir zwei unabhängige Methoden vor, um die Authentizität der Transkonjuganten zu testen, nämlich einen kolorimetrischen Marker in MacConkey-Agar und den PCR-Nachweis der Replikons und Antibiotikaresistenzgene des konjugativen Plasmids im Empfänger. Das hier beschriebene Protokoll dient auch dazu, konjugative Plasmide von umweltbedingten, kommensalen und pathogenen Mitgliedern der Familie Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonellen, Shigellen und andere Arten) zu isolieren und zu charakterisieren.
Um die Mechanik der Konjugation zu verstehen, wurden experimentelle Beobachtungen mit Hilfe von Computersimulationen modelliert. Diese Vorhersagemodelle schätzen die Häufigkeit des Plasmidtransfers für gegebene Wachstumsdichten von Spendern, Empfängern und Transkonjutanten. Ein Modell, das als Endpunktmodell bekannt ist, fand Schwellenwerte, oberhalb derer die Plasmidtransferrate in der Flüssigkeitskultur liegt, und kam zu dem Schluss, dass die Transferrate nicht von der Zelldichte, dem Spender-Empfänger-Verhältnis und der Paarungszeit beeinflusst wird19. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) wurde als alternative Methode zur Detektion transkonjuganter Plasmide verwendet. FISH ermöglicht die Plasmid-Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie durch die Hybridisierung einer DNA-Sonde und einer Ziel-DNA. Somit ermöglicht FISH die visuelle Detektion von Plasmidflüssen über verschiedene Zellpopulationenhinweg 37, obwohl es nicht die gleiche Sensitivität wie die hier vorgestellte Methode aufweist, wenn Transkonjuganten durch visuelles Screening und nicht durch Selektion nachgewiesen werden.
Es besteht ein enormer Bedarf, die Biologie konjugativer Plasmide zu verstehen, die Antibiotikaresistenzgene durch verschiedene Komponenten des Ökosystems (Klinik, Landwirtschaft, Abwasser, Wildtiere, Haustiere, Böden, Flüsse und Seen) verteilen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vereinfachten experimentellen Bedingungen, die in den hier beschriebenen Protokollen dargestellt werden, das Screening von Spendern in großem Maßstab erleichtern und somit ein Schlüsselinstrument für die Untersuchung des horizontalen Gentransfers darstellen, der von konjugativen Plasmiden aus einer Vielzahl von Quellen ausgeht. Sie können verwendet werden, um die Prävalenz von Antibiotikaresistenzgenen oder anderen klinisch relevanten Genen in konjugativen Plasmiden aus mehreren Quellen und Bakterien zu untersuchen. Sie können auch für die Untersuchung der Konjugation in vivo (z. B. im Darm von Wirbeltieren) und zur Untersuchung der Bedingungen angepasst werden, die die Effizienz der Konjugation modulieren. All diese Studien werden wesentlich zum Verständnis beitragen, wie die Mobilisierung multiresistenter konjugativer Plasmide zur Ausbreitung von Multidrug-Resistenzen beiträgt.
The authors have nothing to disclose.
LM-B, IMG, AT und IS wurden durch den NIH-Zuschuss GM055246 unterstützt, der LM-B gewährt wurde. GC-C wurde für zwei aufeinanderfolgende Jahre mit dem UC MEXUS-CONACYT Postdoctoral Fellowship ausgezeichnet: AY 2017-18 und 2018-19. Wir danken den Studenten Sage Chavez und Pepper St. Clair vom Mentoring-Programm des von der Genentech-Stiftung gesponserten Academic Inspiration Network (GAIN) für ihre technische Unterstützung bei den Experimenten.
1.5 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 22-313630 | It can be replaced for another brand |
2.0 mL Cryogenic vials | Corning | 430659 | It can be replaced for another brand |
14 mL conical tubes | FALCON | 149597 | It can be replaced for another brand |
14 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 8850 | It can be replaced for another brand |
1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N0552G | |
250 mL sterile flasks | PYREX | 5320 | It can be replaced for another permanent marker brand |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38SI-212 | It can be replaced for another brand |
Agarose (molecular biology grade, multipurpose) | Fisher Scientific | BP160-500 | It can be replaced for another brand |
Carbenicillin | GOLD BIOTECHNOLOGY | C-103-50 | It can be replaced for another brand |
Disposable inoculating loops: 1 µL | Fisherbrand | 22-363-595 | It can be replaced for another brand |
DNA gel loading dye 6x | New England Biolabs | B7024S | It can be replaced for another brand |
EDTA | Fisher Scientific | BP119-500 | It can be replaced for another brand |
Electronic digital scale | Denver Instrument | APX-2001 | It can be replaced for another brand |
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL | Eppendorf | 14-282-302 | It can be replaced for another brand |
Equipment for agarose gel electrophoresis | Fisher Scientific | FP300 | It can be replaced for another brand |
Ethanol-resistant markers | Sharpie | 37001; 37002; 37003 | It can be replaced for another brand |
Gel documentation systems (UVP GelSolo) | Analytakjena | SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 | It can be replaced for another brand |
Gloves | X-GEN | 44-100M | Any nitrile gloves brand works |
Ice bucket | Thermo Fisher Scientific | 432128 | It can be replaced for another brand |
MacConkey agar | BD DIFCO | 212123 | |
Master Mix | BioLabs | M0496S | It can be replaced for another brand |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | It can be replaced for another brand |
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL | Fisherbrand | 05-408-138 | It can be replaced for another brand |
Mueller Hinton agar | BD DIFCO | DF0479-17-3 | |
Mueller Hinton broth | BD DIFCO | 275730 | |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL | 740588. 250 | |
PCR tube racks | AXYGEN | R96PCRFSP | It can be replaced for another brand |
PCR tubes (0.2 mL) | AXYGEN | PCR-02-C | It can be replaced for another brand |
Rifampicin | Fisher Scientific | 50-164-7517 | |
Set of micropipettes that dispense between 1 – 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) | RAININ | 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 | Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-3 | It can be replaced for another brand |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | 335905P | It can be replaced for another brand |
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL | Eclipse | 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 | It can be replaced for another brand |
Streptomycin | Fisher Scientific | BP910-50 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
Taq DNA Polymerase | BioLabs | M0273S | |
Thermal cycler C1000 Touch | Bio-Rad | 1851196 | It can be replaced for another brand |
Tris | Fisher Scientific | BP153-500 | It can be replaced for another brand |