Summary

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Published: September 13, 2022
doi:

Summary

Kromozom ayrışmasında hata, oositlerde yaygın bir özelliktir. Bu nedenle, iş mili montaj kontrol noktasının incelenmesi, sağlıklı yumurta üretmek için gereken mekanizmalar hakkında önemli ipuçları verir. Mevcut protokol, fare oositlerinde iş mili montaj kontrol noktası bütünlüğünü değerlendirmek için üç tamamlayıcı tahlil tanımlamaktadır.

Abstract

Anöploidi, insanlarda erken düşüklere ve gebelik başarısızlığına neden olan önde gelen genetik anormalliktir. Anöploidiye yol açan kromozom ayrışmasındaki hataların çoğu, oositlerde mayoz sırasında meydana gelir, ancak oosit mayozunun neden hataya eğilimli olduğu hala tam olarak anlaşılamamıştır. Hücre bölünmesi sırasında, hücreler iş mili montaj kontrol noktasını (SAC) etkinleştirerek kromozom ayrışmasındaki hataları önler. Bu kontrol mekanizması, kinetochore (KT)-mikrotübül (MT) ataşmanlarını algılamaya ve iğ lifleri tarafından üretilen gerilimi algılamaya dayanır. KT’ler takılı olmadığında, SAC etkinleştirilir ve hücre döngüsünün ilerlemesini önler. SAC ilk olarak MPS1 kinaz tarafından aktive edilir ve bu da MAD1, MAD2, BUB3 ve BUBR1’den oluşan mitotik kontrol noktası kompleksinin (MCC) işe alınmasını ve oluşumunu tetikler. Daha sonra, MCC sitoplazmaya yayılır ve anafazı teşvik eden karmaşık / siklozom (APC / C) aktivatörü olan CDC20’yi ayırır. KT’ler mikrotübüllere bağlandığında ve kromozomlar metafaz plakasında hizalandığında, SAC susturulur, CDC20 serbest bırakılır ve APC / C aktive edilir, Siklin B ve Sekürin’in bozulmasını tetikler, böylece anafaz başlangıcına izin verir. Somatik hücrelerle karşılaştırıldığında, oositlerdeki SAC o kadar etkili değildir, çünkü hücreler bağlanmamış KT’lere sahip olmalarına rağmen anafaza maruz kalabilirler. SAC’nin neden daha izin verici olduğunu ve bu izin vermenin oositlerde kromozom ayrışma hatalarının nedenlerinden biri olup olmadığını anlamak hala daha fazla araştırmaya ihtiyaç duymaktadır. Mevcut protokol, fare oositlerinde SAC bütünlüğünü kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için üç tekniği açıklamaktadır. Bu teknikler arasında SAC yanıtını değerlendirmek için MT’leri depolimerize etmek için nokodazol kullanılması, Securin yıkımının kinetiğini takip ederek SAC susturulmasının izlenmesi ve MAD2’nin immünofloresan yoluyla KIT’lere alımının değerlendirilmesi yer almaktadır. Bu teknikler birlikte, SAC bütünlüğünün tam bir değerlendirmesini sağlayarak sağlıklı yumurta üretmek için gerekli mekanizmaları araştırır.

Introduction

Kromozom ayrışmasındaki hatalardan kaynaklanan anöploidi, erken düşüklerin önde gelen nedenidir ve mayoz1’deki hatalarla oldukça bağlantılıdır. Mayoz, mitozdan farklıdır, çünkü araya giren bir DNA replikasyon adımı olmadan iki tur hücre bölünmesinden oluşur. Mayoz I’de, homolog kromozomlar ayrılırken, kardeş kromatitler birlikte kalır. Oositlerde, bu adım hataya eğilimlidir ve anöploid yumurta üretimineyol açar 2.

Kromozom ayrışma hatalarını önlemek için, çoğu hücre tipi, iş mili montaj kontrol noktası (SAC) adı verilen hücre döngüsünü duraklatan bir gözetim mekanizmasını etkinleştirir. Bu mekanizma kinetochore (KT)-mikrotübül (MT) ataşmanlarını algılar ve kromozomlar bipolar bir şekilde yönlendirildiğinde gerilim oluşur3. Bağlanmamış kinetochores, SAC’nin ana regülatörü MPS1’in kinetochores 3,4’e işe alınmasıyla başlayan bir SAC yanıtını tetikler. MPS1, mitotik kontrol noktası kompleksini (MCC) oluşturmak için bir platform görevi gören diğer SAC bileşenlerinin işe alımını başlatır. MAD1, MAD2, BUB3 ve BUBR1’den oluşan MCC, sitoplazmaya yayılır ve aktivatörü CDC20’yi ayırarak APC / C aktivasyonunu inhibe eder. Tüm kinetochores MT’lere kararlı bir şekilde bağlandıktan ve kromozomlar metafaz plakasında hizalandıktan sonra, SAC susturulur ve MCC CDC20’yi söker ve serbest bırakır, böylece APC / C aktivasyonuna izin verir. Aktif APC / C, anafaz başlangıcı 5,6’yı tetiklemede iki önemli adım olan Sekürin ve Siklin B’yi bozar. Somatik hücrelerde, SAC sıkıdır, çünkü tek bir bağlanmamış kinetochore tarafından aktive edilir ve hücre döngüsü tutuklamasını indüklemek içinyeterlidir 6. Bununla birlikte, oosit mayozu sırasında, SAC daha izin verir ve oositler bir veya daha fazla bağlanmamış kinetochores 6,7,8,9,10 ile anafaz I’e girebilir. SAC’nin oositlerde neden daha izin verici olduğunu anlamak, bu alanda devam eden bir odak alanıdır. SAC aktivasyonunda veya SAC susturmasında kusurlara neden olan mekanizmalar, kromozom ayrışmasında hatalara veya uzun süreli hücre döngüsü durmasına ve hücre ölümüne neden olabilir. Bu nedenle, oositlerde SAC bütünlüğünü koruyan mekanizmaların değerlendirilmesi, sağlıklı, öploid yumurtaların oluşma sürecini anlamak için önemlidir.

Bu protokol, kontrol noktasının farklı kritik adımlarını inceleyerek fare oosit mayozunda SAC bütünlüğünü kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için teknikleri açıklar. İlk olarak, SAC aktivasyonunu indükledikten sonra SAC yanıtının değerlendirilmesi açıklanmaktadır. Bu aktivasyon, MTs11’i depolimerize eden bir ilaç olan nocodazole kullanılarak bağlanmamış kinetochores üretilerek elde edilir. İkincisi, SAC’nin susturulmasını izlemek için bir yöntem, oosit olgunlaşması sırasında Sekürin yıkımının dinamiklerini izleyerek açıklanmaktadır. Son olarak, MCC bileşenlerinden biri olan MAD2’nin kinetochores’e alımını ölçmek için immünofloresan tabanlı bir tahlil kullanılır. Birlikte, bu testler oosit mayotik olgunlaşması sırasında SAC bütünlüğünü kapsamlı bir şekilde değerlendirir.

Protocol

Bu protokollerde kullanılan tüm fareler, Rutgers Üniversitesi Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakım Komitesi (Protokol 201702497) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına göre barındırılmış ve yetiştirilmiştir. Bu düzenleyici kurumlar, hayvan çalışmalarını içeren tüm deneysel prosedürleri onayladı. Bu çalışmada kullanılan tüm fareler 6-8 haftalık CF-1 dişileriydi. 1. Deneysel hazırlık SAC değerlendirmelerine başlamadan önce, da…

Representative Results

NOKODAZOL tedavisi ile SAC yanıtının değerlendirilmesiBu deneyin amacı SAC aktivasyonunu ve gücünü değerlendirmektir. İş mili mikrotübüllerini depolimerize etmek için nokodazol kullanılarak, tüm kinetochores bağlanmamış olacak ve bu da SAC aracılı hücre döngüsü durmasına neden olacaktır. Mevcut görüntüleme sisteminde, DMSO ile tedavi edilen kontrol oositleri, milrinondan salındıktan yaklaşık 14 saat sonra polar bir gövdeyi ekstrüde etti (Şekil…

Discussion

İş mili montaj kontrol noktası, kromozom ayrışma hatalarını önlemek için tasarlanmış hücre bölünmesi sırasında kritik bir kontrol mekanizmasıdır. Hücrenin yanlış KT-MT eklerini düzeltmek için yeterli zamana sahip olmasını sağlar. Oositlerde mayoz, kromozom yanlış ayrışmasının çoğunun mayoz I sırasında meydana geldiği ve insanlarda erken düşüklerin ve kısırlığın ana nedeni olan anöploid yumurtaların üretilmesine yol açan hataya eğilimli bir süreçtir</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu projenin finansmanı Ulusal Sağlık Enstitüleri (R35GM136340 – KS) tarafından sağlanmıştır.

Materials

Bovine serum albumin (BSA) Sigma A4503
DAPI Life Technologies D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) Sigma D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 Life Technologies A10042
EVOS FL Auto Imaging System Life Technologies Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator Life Technologies Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated MatTek Corporation P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633 Life Technologies A21091
HEPES Sigma H3537
Human anti-ACA Antibodies Incorporated 15-234 Dilution 1/30
ImageJ NIH
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective Leica
MgSO4·7H20 Sigma M7774
Milrinone Sigma M4659
Na2HPO4 Sigma S2429
NaCl Sigma S5886
NaN3 Sigma S2002
Nocodazole Sigma M1404
Paraformaldhyde (PFA) Sigma P6148
PIPES Sigma P6757
Rabbit anti- MAD2 Biolegend 924601 Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine Cayman Chemical 10004412
Triton-X Sigma 274348
Tween-20 Sigma X100
Vectashield Vector laboratories H-1000

References

  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
  3. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  4. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
  5. London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
  6. Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
  7. Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  8. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  9. Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
  10. Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
  11. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  12. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
  13. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
  14. Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
  15. Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
  16. Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
  17. Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
  18. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  19. Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
  20. Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
  21. Santaguida, S., Tighe, A., D’Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
  22. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  23. Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
  24. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
  25. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  26. Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
  27. Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
  28. Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
  29. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  30. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).

Play Video

Cite This Article
Aboelenain, M., Schindler, K., Blengini, C. S. Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (187), e64459, doi:10.3791/64459 (2022).

View Video