Kromozom ayrışmasında hata, oositlerde yaygın bir özelliktir. Bu nedenle, iş mili montaj kontrol noktasının incelenmesi, sağlıklı yumurta üretmek için gereken mekanizmalar hakkında önemli ipuçları verir. Mevcut protokol, fare oositlerinde iş mili montaj kontrol noktası bütünlüğünü değerlendirmek için üç tamamlayıcı tahlil tanımlamaktadır.
Anöploidi, insanlarda erken düşüklere ve gebelik başarısızlığına neden olan önde gelen genetik anormalliktir. Anöploidiye yol açan kromozom ayrışmasındaki hataların çoğu, oositlerde mayoz sırasında meydana gelir, ancak oosit mayozunun neden hataya eğilimli olduğu hala tam olarak anlaşılamamıştır. Hücre bölünmesi sırasında, hücreler iş mili montaj kontrol noktasını (SAC) etkinleştirerek kromozom ayrışmasındaki hataları önler. Bu kontrol mekanizması, kinetochore (KT)-mikrotübül (MT) ataşmanlarını algılamaya ve iğ lifleri tarafından üretilen gerilimi algılamaya dayanır. KT’ler takılı olmadığında, SAC etkinleştirilir ve hücre döngüsünün ilerlemesini önler. SAC ilk olarak MPS1 kinaz tarafından aktive edilir ve bu da MAD1, MAD2, BUB3 ve BUBR1’den oluşan mitotik kontrol noktası kompleksinin (MCC) işe alınmasını ve oluşumunu tetikler. Daha sonra, MCC sitoplazmaya yayılır ve anafazı teşvik eden karmaşık / siklozom (APC / C) aktivatörü olan CDC20’yi ayırır. KT’ler mikrotübüllere bağlandığında ve kromozomlar metafaz plakasında hizalandığında, SAC susturulur, CDC20 serbest bırakılır ve APC / C aktive edilir, Siklin B ve Sekürin’in bozulmasını tetikler, böylece anafaz başlangıcına izin verir. Somatik hücrelerle karşılaştırıldığında, oositlerdeki SAC o kadar etkili değildir, çünkü hücreler bağlanmamış KT’lere sahip olmalarına rağmen anafaza maruz kalabilirler. SAC’nin neden daha izin verici olduğunu ve bu izin vermenin oositlerde kromozom ayrışma hatalarının nedenlerinden biri olup olmadığını anlamak hala daha fazla araştırmaya ihtiyaç duymaktadır. Mevcut protokol, fare oositlerinde SAC bütünlüğünü kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için üç tekniği açıklamaktadır. Bu teknikler arasında SAC yanıtını değerlendirmek için MT’leri depolimerize etmek için nokodazol kullanılması, Securin yıkımının kinetiğini takip ederek SAC susturulmasının izlenmesi ve MAD2’nin immünofloresan yoluyla KIT’lere alımının değerlendirilmesi yer almaktadır. Bu teknikler birlikte, SAC bütünlüğünün tam bir değerlendirmesini sağlayarak sağlıklı yumurta üretmek için gerekli mekanizmaları araştırır.
Kromozom ayrışmasındaki hatalardan kaynaklanan anöploidi, erken düşüklerin önde gelen nedenidir ve mayoz1’deki hatalarla oldukça bağlantılıdır. Mayoz, mitozdan farklıdır, çünkü araya giren bir DNA replikasyon adımı olmadan iki tur hücre bölünmesinden oluşur. Mayoz I’de, homolog kromozomlar ayrılırken, kardeş kromatitler birlikte kalır. Oositlerde, bu adım hataya eğilimlidir ve anöploid yumurta üretimineyol açar 2.
Kromozom ayrışma hatalarını önlemek için, çoğu hücre tipi, iş mili montaj kontrol noktası (SAC) adı verilen hücre döngüsünü duraklatan bir gözetim mekanizmasını etkinleştirir. Bu mekanizma kinetochore (KT)-mikrotübül (MT) ataşmanlarını algılar ve kromozomlar bipolar bir şekilde yönlendirildiğinde gerilim oluşur3. Bağlanmamış kinetochores, SAC’nin ana regülatörü MPS1’in kinetochores 3,4’e işe alınmasıyla başlayan bir SAC yanıtını tetikler. MPS1, mitotik kontrol noktası kompleksini (MCC) oluşturmak için bir platform görevi gören diğer SAC bileşenlerinin işe alımını başlatır. MAD1, MAD2, BUB3 ve BUBR1’den oluşan MCC, sitoplazmaya yayılır ve aktivatörü CDC20’yi ayırarak APC / C aktivasyonunu inhibe eder. Tüm kinetochores MT’lere kararlı bir şekilde bağlandıktan ve kromozomlar metafaz plakasında hizalandıktan sonra, SAC susturulur ve MCC CDC20’yi söker ve serbest bırakır, böylece APC / C aktivasyonuna izin verir. Aktif APC / C, anafaz başlangıcı 5,6’yı tetiklemede iki önemli adım olan Sekürin ve Siklin B’yi bozar. Somatik hücrelerde, SAC sıkıdır, çünkü tek bir bağlanmamış kinetochore tarafından aktive edilir ve hücre döngüsü tutuklamasını indüklemek içinyeterlidir 6. Bununla birlikte, oosit mayozu sırasında, SAC daha izin verir ve oositler bir veya daha fazla bağlanmamış kinetochores 6,7,8,9,10 ile anafaz I’e girebilir. SAC’nin oositlerde neden daha izin verici olduğunu anlamak, bu alanda devam eden bir odak alanıdır. SAC aktivasyonunda veya SAC susturmasında kusurlara neden olan mekanizmalar, kromozom ayrışmasında hatalara veya uzun süreli hücre döngüsü durmasına ve hücre ölümüne neden olabilir. Bu nedenle, oositlerde SAC bütünlüğünü koruyan mekanizmaların değerlendirilmesi, sağlıklı, öploid yumurtaların oluşma sürecini anlamak için önemlidir.
Bu protokol, kontrol noktasının farklı kritik adımlarını inceleyerek fare oosit mayozunda SAC bütünlüğünü kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için teknikleri açıklar. İlk olarak, SAC aktivasyonunu indükledikten sonra SAC yanıtının değerlendirilmesi açıklanmaktadır. Bu aktivasyon, MTs11’i depolimerize eden bir ilaç olan nocodazole kullanılarak bağlanmamış kinetochores üretilerek elde edilir. İkincisi, SAC’nin susturulmasını izlemek için bir yöntem, oosit olgunlaşması sırasında Sekürin yıkımının dinamiklerini izleyerek açıklanmaktadır. Son olarak, MCC bileşenlerinden biri olan MAD2’nin kinetochores’e alımını ölçmek için immünofloresan tabanlı bir tahlil kullanılır. Birlikte, bu testler oosit mayotik olgunlaşması sırasında SAC bütünlüğünü kapsamlı bir şekilde değerlendirir.
İş mili montaj kontrol noktası, kromozom ayrışma hatalarını önlemek için tasarlanmış hücre bölünmesi sırasında kritik bir kontrol mekanizmasıdır. Hücrenin yanlış KT-MT eklerini düzeltmek için yeterli zamana sahip olmasını sağlar. Oositlerde mayoz, kromozom yanlış ayrışmasının çoğunun mayoz I sırasında meydana geldiği ve insanlarda erken düşüklerin ve kısırlığın ana nedeni olan anöploid yumurtaların üretilmesine yol açan hataya eğilimli bir süreçtir</su…
The authors have nothing to disclose.
Bu projenin finansmanı Ulusal Sağlık Enstitüleri (R35GM136340 – KS) tarafından sağlanmıştır.
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
DAPI | Life Technologies | D1306 | |
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
HEPES | Sigma | H3537 | |
Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
ImageJ | NIH | ||
KCl | Sigma | P5405 | |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
Milrinone | Sigma | M4659 | |
Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
NaN3 | Sigma | S2002 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
PIPES | Sigma | P6757 | |
Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
Triton-X | Sigma | 274348 | |
Tween-20 | Sigma | X100 | |
Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |