Evaluatie van de integriteit van het spindelassemblagecontrolepunt in muizenoöcyten
Summary
Fout in chromosoomsegregatie is een veel voorkomend kenmerk in eicellen. Daarom geeft het bestuderen van het controlepunt voor de spindelassemblage belangrijke aanwijzingen over de mechanismen die nodig zijn om gezonde eieren te produceren. Het huidige protocol beschrijft drie complementaire testen om de integriteit van het controlepunt van de spindelassemblage in muizenoöcyten te evalueren.
Abstract
Aneuploïdie is de belangrijkste genetische afwijking die een vroege miskraam en zwangerschapsfalen bij mensen veroorzaakt. De meeste fouten in chromosoomsegregatie die aanleiding geven tot aneuploïdie treden op tijdens meiose in eicellen, maar waarom oöcyten meiose foutgevoelig is, is nog steeds niet volledig begrepen. Tijdens de celdeling voorkomen cellen fouten in chromosoomsegregatie door het spindelassemblagecheckpoint (SAC) te activeren. Dit controlemechanisme is gebaseerd op het detecteren van kinetochore (KT) -microtubule (MT) hulpstukken en het detecteren van spanning gegenereerd door spindelvezels. Wanneer KT’s niet worden losgemaakt, wordt de SAC geactiveerd en voorkomt de progressie van de celcyclus. De SAC wordt eerst geactiveerd door MPS1-kinase, wat de rekrutering en vorming van het mitotische checkpointcomplex (MCC) activeert, bestaande uit MAD1, MAD2, BUB3 en BUBR1. Vervolgens diffundeert de MCC in het cytoplasma en sekwesters CDC20, een anafase-bevorderende complex / cyclosoom (APC / C) activator. Zodra KT’s gehecht raken aan microtubuli en chromosomen zijn uitgelijnd op de metafaseplaat, wordt de SAC gedempt, cdc20 vrijgegeven en wordt de APC / C geactiveerd, waardoor de afbraak van cycline B en securine wordt veroorzaakt, waardoor anafase kan beginnen. In vergelijking met somatische cellen is de SAC in eicellen niet zo effectief omdat cellen anafase kunnen ondergaan ondanks het feit dat ze niet-gehechte KT’s hebben. Begrijpen waarom de SAC meer tolerant is en of deze permissiviteit een van de oorzaken is van chromosoomsegregatiefouten in eicellen moet nog verder worden onderzocht. Het huidige protocol beschrijft de drie technieken om de SAC-integriteit in muizenoöcyten uitgebreid te evalueren. Deze technieken omvatten het gebruik van nocodazol om MT’s te depolymeriseren om de SAC-respons te evalueren, het volgen van SAC-uitschakeling door de kinetiek van Securin-vernietiging te volgen en het evalueren van de rekrutering van MAD2 naar KT’s door immunofluorescentie. Samen onderzoeken deze technieken mechanismen die nodig zijn om gezonde eieren te produceren door een volledige evaluatie van de SAC-integriteit te bieden.
Introduction
Aneuploïdie, die voortkomt uit fouten in chromosoomsegregatie, is de belangrijkste oorzaak van vroege miskramen en is sterk gekoppeld aan fouten bij meiose1. Meiose onderscheidt zich van mitose omdat het bestaat uit twee rondes van celdeling zonder een tussenliggende DNA-replicatiestap. Bij meiose I scheiden homologe chromosomen terwijl zusterchromatiden bij elkaar blijven. Bij eicellen is deze stap foutgevoelig, wat leidt tot aneuploïde eiproductie2.
Om fouten in chromosoomsegregatie te voorkomen, activeren de meeste celtypen een bewakingsmechanisme dat de celcyclus pauzeert, het spindelassemblagecontrolepunt (SAC) genoemd. Dit mechanisme detecteert kinetochore (KT)-microtubule (MT) aanhechtingen en de spanning wordt gegenereerd wanneer chromosomen op een bipolaire manier worden georiënteerd3. Ongebonden kinetochoren veroorzaken een SAC-respons die begint met de rekrutering van MPS1, de hoofdregulator van de SAC, tot kinetochoren 3,4. MPS1 initieert de werving van andere SAC-componenten en fungeert als een platform om het mitotische checkpointcomplex (MCC) te vormen. De MCC, bestaande uit MAD1, MAD2, BUB3 en BUBR1, diffundeert in het cytoplasma en remt APC / C-activering door zijn activator CDC20 te sekwestreren. Zodra alle kinetochoren stabiel aan MT’s zijn bevestigd en chromosomen zijn uitgelijnd op de metafaseplaat, wordt de SAC gedempt en de MCC demonteert en geeft CDC20 vrij, waardoor APC / C-activering mogelijk wordt. Actieve APC/C degradeert Securin en Cyclin B, twee belangrijke stappen bij het activeren van het begin van de anafase 5,6. In somatische cellen is de SAC streng omdat deze wordt geactiveerd door een enkel niet-vastgemaakt kinetochore en voldoende is om celcyclusstilstand te induceren6. Tijdens eicel meiose is de SAC echter meer tolerant en kunnen eicellen anafase I binnengaan met een of meer niet-vastgemaakte kinetochoren 6,7,8,9,10. Begrijpen waarom de SAC meer toegeeflijk is in eicellen is een voortdurend aandachtsgebied in het veld. Mechanismen die defecten in SAC-activering of SAC-uitschakeling veroorzaken, kunnen leiden tot fouten in chromosoomsegregatie of langdurige celcyclusstilstand en celdood. Daarom is het evalueren van de mechanismen die de SAC-integriteit in eicellen handhaven belangrijk om het proces van het vormen van gezonde, euploïde eieren te begrijpen.
Dit protocol beschrijft technieken om de SAC-integriteit bij muizenoöcyten meiose uitgebreid te evalueren door verschillende kritieke stappen van het controlepunt te onderzoeken. Eerst wordt de evaluatie van de SAC-respons na het induceren van SAC-activering beschreven. Deze activering wordt bereikt door het genereren van niet-gehechte kinetochoren met behulp van nocodazol, een medicijn dat MT’s11 depolymeriseert. Ten tweede wordt een methode om SAC-uitschakeling te monitoren beschreven door de dynamiek van Securin-afbraak tijdens de rijping van eicellen te volgen. Ten slotte wordt een op immunofluorescentie gebaseerde test gebruikt om de rekrutering van MAD2, een van de MCC-componenten, naar kinetochoren te meten. Samen beoordelen deze testen uitgebreid de SAC-integriteit tijdens de meiotische rijping van eicellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het controlepunt voor de assemblage van de spindel is een kritisch controlemechanisme tijdens de celdeling dat is ontworpen om fouten in de chromosoomsegregatie te voorkomen. Het stelt de cel in staat om voldoende tijd te hebben om onjuiste KT-MT-bijlagen te corrigeren. Meiose in eicellen is een foutgevoelig proces, waarbij het grootste deel van de chromosoommissegregatie optreedt tijdens meiose I, wat leidt tot het genereren van aneuploïde eieren die de belangrijkste oorzaak zijn van vroege miskramen en onvruchtbaarhei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering voor dit project werd verstrekt door de National Institutes of Health (R35GM136340 naar KS).
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
- London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
- Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
- Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
- Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
- Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
- Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
- Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
- Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
- Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
- Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
- Santaguida, S., Tighe, A., D’Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
- Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
- Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).
