تقييم سلامة نقطة تفتيش تجميع المغزل في بويضات الفأر
Summary
الخطأ في فصل الكروموسومات هو سمة شائعة في البويضات. لذلك ، فإن دراسة نقطة تفتيش تجميع المغزل تعطي أدلة مهمة حول الآليات اللازمة لإنتاج بيض صحي. يصف البروتوكول الحالي ثلاثة مقايسات تكميلية لتقييم سلامة نقطة تفتيش تجميع المغزل في بويضات الفئران.
Abstract
اختلال الصيغة الصبغية هو الشذوذ الوراثي الرئيسي الذي يسبب الإجهاض المبكر وفشل الحمل لدى البشر. تحدث معظم الأخطاء في فصل الكروموسومات التي تؤدي إلى اختلال الصيغة الصبغية أثناء الانقسام الميوزي في البويضات ، ولكن لماذا يكون الانقسام الاختزالي للخلايا البيضية عرضة للخطأ لا يزال غير مفهوم تماما. أثناء انقسام الخلايا ، تمنع الخلايا الأخطاء في فصل الكروموسومات عن طريق تنشيط نقطة فحص تجميع المغزل (SAC). تعتمد آلية التحكم هذه على اكتشاف مرفقات كينيتوخور (KT) – الأنابيب الدقيقة (MT) واستشعار التوتر الناتج عن ألياف المغزل. عندما تكون KTs غير متصلة ، يتم تنشيط SAC ويمنع تقدم دورة الخلية. يتم تنشيط SAC أولا بواسطة كيناز MPS1 ، والذي يؤدي إلى تجنيد وتشكيل مجمع نقطة التفتيش الانقسامية (MCC) ، المكون من MAD1 و MAD2 و BUB3 و BUBR1. بعد ذلك ، ينتشر MCC في السيتوبلازم ويعزل CDC20 ، وهو منشط مركب / سيكلوسوم معزز للطور (APC / C). بمجرد أن تصبح KTs متصلة بالأنابيب الدقيقة ويتم محاذاة الكروموسومات في لوحة الطور ، يتم إسكات SAC ، ويتم إطلاق CDC20 ، ويتم تنشيط APC / C ، مما يؤدي إلى تدهور Cyclin B و Securin ، مما يسمح ببداية الطور. بالمقارنة مع الخلايا الجسدية ، فإن SAC في البويضات ليست فعالة لأن الخلايا يمكن أن تخضع للطور الانفصالي على الرغم من وجود KTs غير مرتبطة. إن فهم سبب كون SAC أكثر تساهلا وما إذا كان هذا التساهل هو أحد أسباب أخطاء فصل الكروموسومات في البويضات لا يزال بحاجة إلى مزيد من التحقيق. يصف البروتوكول الحالي التقنيات الثلاث لتقييم سلامة SAC بشكل شامل في بويضات الفئران. تتضمن هذه التقنيات استخدام نوكودازول لإزالة بلمرة MTs لتقييم استجابة SAC ، وتتبع إسكات SAC باتباع حركية تدمير Securin ، وتقييم توظيف MAD2 إلى KTs عن طريق التألق المناعي. تعمل هذه التقنيات معا على فحص الآليات اللازمة لإنتاج بويضات صحية من خلال توفير تقييم كامل لسلامة SAC.
Introduction
اختلال الصيغة الصبغية ، الذي ينشأ عن أخطاء في فصل الكروموسومات ، هو السبب الرئيسي للإجهاض المبكر ويرتبط ارتباطا وثيقا بالأخطاء في الانقسام الاختزالي1. يختلف الانقسام الميوزي عن الانقسام الميتوزي؛ لأنه يتكون من جولتين من الانقسام الخلوي دون تدخل خطوة تضاعف الحمض النووي (DNA). في الانقسام الميوزي الأول، تنفصل الكروموسومات المتماثلة بينما تظل الكروماتيدات الشقيقة معا. في البويضات ، تكون هذه الخطوة عرضة للخطأ ، مما يؤدي إلى إنتاج بيض اختلال الصيغة الصبغية2.
لمنع أخطاء فصل الكروموسومات ، تقوم معظم أنواع الخلايا بتنشيط آلية مراقبة توقف دورة الخلية مؤقتا ، تسمى نقطة تفتيش تجميع المغزل (SAC). تستشعر هذه الآلية مرفقات الكينيتوخور (KT) – الأنابيب الدقيقة (MT) ويتم توليد التوتر عندما يتم توجيه الكروموسومات بطريقة ثنائية القطب3. تؤدي الحركية غير المرتبطة إلى استجابة SAC التي تبدأ بتوظيف MPS1 ، المنظم الرئيسي ل SAC ، إلى kinetochores 3,4. يبدأ MPS1 في توظيف مكونات SAC الأخرى ، حيث يعمل كمنصة لتشكيل مجمع نقاط التفتيش الانقسامية (MCC). ينتشر MCC ، المكون من MAD1 و MAD2 و BUB3 و BUBR1 ، في السيتوبلازم ويمنع تنشيط APC / C عن طريق عزل المنشط CDC20. بمجرد ربط جميع الحركية بثبات ب MTs ومحاذاة الكروموسومات في لوحة الطور ، يتم إسكات SAC ، ويتم تفكيك MCC وإطلاق CDC20 ، مما يسمح بتنشيط APC / C. يؤدي APC / C النشط إلى تدهور Securin و Cyclin B ، وهما خطوتان رئيسيتان في تحفيز بداية الطور 5,6. في الخلايا الجسدية ، يكون SAC صارما لأنه يتم تنشيطه بواسطة حركية واحدة غير متصلة وهو كاف للحث على إيقاف دورة الخلية6. ومع ذلك ، أثناء الانقسام الاختزالي للخلايا البيضية ، يكون SAC أكثر تساهلا ، ويمكن أن تدخل البويضات في الطور الانفصالي الأول مع واحد أو أكثر من الحركية غير المرتبطة6،7،8،9،10. إن فهم سبب كون SAC أكثر تساهلا في البويضات هو مجال تركيز مستمر في هذا المجال. يمكن أن تؤدي الآليات التي تسبب عيوبا في تنشيط SAC أو إسكات SAC إلى أخطاء في فصل الكروموسومات أو توقف دورة الخلية لفترات طويلة وموت الخلايا. لذلك ، فإن تقييم الآليات التي تحافظ على سلامة SAC في البويضات مهم لفهم عملية تكوين بويضات صحية ومتعددة الصبغيات.
يصف هذا البروتوكول تقنيات التقييم الشامل لسلامة SAC في الانقسام الاختزالي لبويضة الفأر من خلال فحص الخطوات الحرجة المختلفة لنقطة التفتيش. أولا ، يتم وصف تقييم استجابة SAC بعد تحفيز تنشيط SAC. يتم تحقيق هذا التنشيط عن طريق توليد حركية غير مرتبطة باستخدام نوكودازول ، وهو دواء يزيل بلمرة MTs11. ثانيا ، يتم وصف طريقة لمراقبة إسكات SAC من خلال تتبع ديناميكيات تدهور Securin أثناء نضوج البويضة. أخيرا ، يتم استخدام مقايسة قائمة على التألق المناعي لقياس تجنيد MAD2 ، أحد مكونات MCC ، إلى الحركية. معا ، تقوم هذه المقايسات بتقييم شامل لسلامة SAC أثناء النضج الاختزالي للبويضة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقطة تفتيش تجميع المغزل هي آلية تحكم حرجة أثناء انقسام الخلايا مصممة لمنع أخطاء فصل الكروموسومات. يسمح للخلية بالحصول على وقت كاف لتصحيح مرفقات KT-MT غير الصحيحة. الانقسام الاختزالي في البويضات هو عملية معرضة للخطأ ، حيث يحدث معظم الفصل الخاطئ للكروموسوم أثناء الانقسام الاختزالي الأول ، مم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل لهذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R35GM136340 إلى KS).
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
- London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
- Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
- Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
- Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
- Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
- Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
- Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
- Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
- Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
- Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
- Santaguida, S., Tighe, A., D’Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
- Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
- Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).
