マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

染色体分配の誤りから生じる異数性は、早期流産の主な原因であり、減数分裂の間違いと強く関連しています¹。減数分裂は、DNA複製ステップを介さずに2ラウンドの細胞分裂で構成されるため、有糸分裂とは異なります。減数分裂Iでは、相同染色体は分離し、姉妹染色分体は一緒に残ります。卵母細胞では、このステップはエラーが発生しやすく、異数性卵の生成につながります²。

染色体分配エラーを防ぐために、ほとんどの細胞タイプは、スピンドルアセンブリチェックポイント(SAC)と呼ばれる細胞周期を一時停止する監視メカニズムを活性化します。このメカニズムは、動原体(KT)-微小管(MT)の付着を感知し、染色体が双極性に配向すると張力が発生します³。接続されていない動原体は、SACのマスターレギュレーターであるMPS1の動原体^3,4への採用から始まるSAC応答をトリガーします。MPS1は、他のSACコンポーネントのリクルートを開始し、有糸分裂チェックポイント複合体(MCC)を形成するためのプラットフォームとして機能します。MCCは、MAD1、MAD2、BUB3、およびBUBR1で構成され、細胞質に拡散し、アクチベーターCDC20を隔離することによりAPC/C活性化を阻害します。すべての動原体がMTに安定して結合し、染色体が中期プレートに整列すると、SACがサイレンシングされ、MCCがCDC20を分解して放出し、APC/C活性化が可能になります。活性APC / Cは、後期発症を引き起こす2つの重要なステップであるセクリンとサイクリンBを分解します^5,6。体細胞では、SACは単一の未付着の動原体によって活性化され、細胞周期停止を誘導するのに十分であるため、厳格です⁶。しかしながら、卵母細胞減数分裂の間、SACはより寛容であり、卵母細胞は1つ以上の未付着の動原体6、^7、8、^9、10で後期Iに入ることができる。SACが卵母細胞においてより寛容である理由を理解することは、この分野で進行中の焦点分野です。SAC活性化またはSACサイレンシングに欠陥を引き起こすメカニズムは、染色体分配のエラーまたは長期の細胞周期停止および細胞死につながる可能性があります。したがって、卵母細胞のSAC完全性を維持するメカニズムを評価することは、健康な倍数体の卵を形成するプロセスを理解するために重要です。

このプロトコルは、チェックポイントのさまざまな重要なステップを調べることにより、マウス卵母細胞減数分裂におけるSAC完全性を包括的に評価する技術について説明しています。まず、SAC活性化誘導後のSAC応答の評価について説明する。この活性化は、^MTs11を解重合する薬物であるノコダゾールを使用して、付着していない動原体を生成することによって達成されます。第二に、SACサイレンシングをモニタリングする方法は、卵母細胞成熟中のSecurin分解のダイナミクスを追跡することによって説明されています。最後に、免疫蛍光ベースのアッセイを使用して、MCC成分の1つであるMAD2の動原体への動員を測定します。一緒に、これらのアッセイは、卵母細胞の減数分裂成熟中のSACの完全性を包括的に評価します。