懸濁3Dバイオプリンティングのためのゲル化中のせん断処理によって形成されたアガロース流体ゲル

注意: このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、機器、およびソフトウェアに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。 1. 流体ゲル懸濁床の作製 2,000 mLのガラス瓶に1,000 mLの超純水(タイプ1、>18 mΩ·cm-1)に5 gのアガロース粉末を加えて、1,000 mLの分散アガロース(0.5% w/v)を調製します。 水性混合物に70 mmのマグネチックスターラーバーを追加し、最初に完全に締めてから4分の1回転緩めてボトルキャップを固定します。 ガラス瓶をオートクレーブのバスケットに入れ、蓋を閉め、121°Cおよび1バールで15分間サイクルを実行して、混合物を溶解および滅菌します。注:このプロトコルは、以降の手順でオートクレーブソリューションに常に使用されます。 オートクレーブが80°Cに冷却されたら、オートクレーブからボトルを取り出し、攪拌を800rpmに設定して、マグネチックスターラー(非加熱)に置きます。注意: ボトルと液体は熱いままです。 周囲条件下でゾルを冷却し、一定の攪拌を維持しながら、温度がそのTゲル(ゲル化点)よりも低くなるまで、32°C。 スターラーからボトルを取り出し、4°Cで保管します。注:液体ゲルは、必要になるまで保管できます。 2.バイオインクの調製 超純水(タイプ1、>18 mΩ·cm-1)中の低アシルジェランガムの1%(w / w)ゾルを使用して、ゲランベースのバイオインクを調製します。0.5 gのジェランパウダーを計量ボートに計量します。 100mLのガラス瓶に超純水49.5gを加え、マグネチックスターラーを加えます。 ジェランパワーが入った計量ボートを半分に折り、絶えず攪拌しながらゆっくりと粉末を水に加えます。 オートクレーブを使用してゾルを溶解および滅菌し、20°Cまで冷却します。 バイオインクは、さらに使用するまで4°Cで保存してください。 超純水(タイプ1、>18mΩ・cm-1)でペクチン-コラーゲン混合バイオインクを調製します。ペクチン粉末2.5gを計量ボートに計量して、ストックの5%(w / v)低メトキシペクチン溶液を調製します。 100mLのガラス瓶に50mLの超純水を加え、マグネチックスターラーで入れます。 ペクチンパワーが入った計量ボートを半分に折り、絶えず攪拌しながらゆっくりと粉末を水に加えます。 水性混合物をオートクレーブし、20°Cに冷却する。 3 mLのペクチン溶液を3 mLのコラーゲン溶液に加えるか、4 mLのペクチン溶液を2 mLのコラーゲン溶液に加えることにより、1:1および2:1のペクチン-コラーゲンブレンドを調製します。混合物を10回引き出して分注することにより、ピペットを使用してブレンドを穏やかに混合します。注意: この手順は、コラーゲンの早期ゲル化を防ぐために、氷上で冷たい材料を使用して行うのが最適です。ペクチンとコラーゲンの予冷は、混合前に4°Cで保存することで達成できます。 さらに使用するまで4°Cで保管してください。 アルギン酸コラーゲン配合バイオインクを超純水(タイプ1、>18mΩ・cm-1)で調製します。アルギン酸塩粉末2 gを計量ボートに入れます。 100mLのガラス瓶に50mLの超純水を加え、マグネチックスターラーで入れます。 アルギン酸塩の力を含む計量ボートを半分に折り、絶えず攪拌しながらゆっくりと粉末を水に加えます。 アルギン酸塩が完全に溶解するまで(透明でわずかに茶色の液体)、絶えず攪拌しながら分散液を60°Cに加熱し、次に20°Cに冷却する。 25 mLのアルギン酸塩溶液を25 mLのDMEMに加えることにより、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)などの細胞培養培地でアルギン酸塩溶液を希釈します。 3 mLのアルギン酸塩/DMEM溶液を3 mLのコラーゲン溶液に加えることにより、アルギン酸塩とコラーゲンのブレンド(1:1)を調製します。混合物を10回引き出して分注することにより、ピペットを使用してブレンドを穏やかに混合し、4°Cで保存します。注意: この手順は、コラーゲンの早期ゲル化を防ぐために、氷上で冷たい材料を使用して行うのが最適です。ペクチンとコラーゲンの予冷は、混合前に4°Cで保存することで達成できます。 3. バイオインクのレオロジー特性評価 レオメーターをオンにし、40 mmの鋸歯状の形状を挿入し、30分間放置します。 ゼロギャップ高さ関数を使用してレオメーターの ギャップ高さをゼロにします。 底板に~2 mLのサンプルを追加し、上部形状を下げて1 mmのギャップ高さを作成します。 プレート間から排出された余分な材料を除去して、サンプルをトリミングします。これを行うには、平らで非研磨性のエッジを使用して、余分な液体を隙間から引き離し、ティッシュペーパーで吸収します。注意: 次の各ステップの前に、サンプルを変更するためにステップ3.2〜3.4が繰り返されます。 バイオインクの注入性を決定するために 粘度測定プロファイル を実施します。ユーザーオプションから粘度測定テストを選択します。 せん断速度制御ランプテストのパラメータを入力します: 0.1〜500 s-1、 ランプ時間は1分です。 ステップ3.5.2のせん断速度制御ランプテストから決定された上下の応力を使用して、応力制御下の新しいサンプルに対して粘度測定ランプテストを繰り返します。 バイオインクのゲル化特性を決定するために 、小さな変形試験 を実施します。ユーザーオプションから振動テストを選択します。 一定のひずみ下での単一の周波数テストへの入力パラメータ: 周波数1Hz、1時間にわたって0.5%のひずみ、インクがゲル化している間。 ゲル化したサンプルの振幅と周波数を その場 で測定します。ユーザーオプションから振動テストを選択します。 振幅掃引を選択し、一定の1Hz周波数で0.01〜500%のひずみ制御された振幅掃引テストのパラメータを入力します。 新しいサンプルをロードし、ユーザーオプションから振動テストを選択します。次に、周波数テストを選択し、0.01〜10Hzの間の周波数パラメータと、ステップ3.7.2で得られた振幅掃引データから決定されたスペクトルの線形粘弾性領域(LVR)内にあるひずみ(典型的にはLVRの50%〜80%の間の値)を入力する。 4. 3Dバイオプリンターを使用した3D構造の設計と印刷 CADソフトウェアを起動して、 CAD モデルの生成を開始します。ツールの選択 | CADソフトウェアの材料を使用して、選択したバイオインクの印刷パラメータを定義します。 使用しているプリンターに関連する印刷パラメータを入力します。たとえば、3D Discoveryの場合、厚さタブに推定フィラメント直径(ほとんどのバイオインクでは~200-500 μm)を入力して、各層のZ厚さを決定します。注:最終構成の層間剥離は厚さの値を増やす必要があることを示し、解像度の低下は厚さを減らす必要性を強調します。 ソフトウェアのレイヤータブを使用して、 レイヤー ごとに目的の構造レイヤーを設計します。[グループ]タブを使用して画層を グループ化 し、[ レベル ]タブを使用して各画層をZ平面上の水準に割り当てます。たとえば、(ステップ2.3で調製したアルギン酸コラーゲン混合バイオインクを使用して)格子構造を生成するには、x軸に沿ってフィラメントを持つ1つの層を作成し、y軸に沿ってフィラメントを持つ2番目の層を作成します。両方を別の レベルに割り当てます。 [ グループ ]タブで、構造内の繰り返し単位数を選択して、造形高さを決定します。 生成ツールをクリックして、設計のGコードを作成し、構造の3Dレンダリングを表示します。 BioCADを閉じ、3Dディスカバリーヒューマンマシンインターフェイス(HMI)ソフトウェアを起動して、印刷プロセスを開始します。製造元の指示に従ってプリントヘッドを組み立てます。マイクロバルブをプリントヘッドに取り付け、選択した押し出しノズルをねじ込みます。 針の長さ測定機能をクリックして、プリントヘッドを調整します。 培養容器(6ウェルプレートなど)を印刷プラットフォームにロードします。 バイオインクを印刷カートリッジに分注し、マイクロバルブの上のプリントヘッドにねじ込みます。 組み立てたプリントヘッドを空気圧システムに接続し 、HMIでプリントヘッド を選択して接続します。 [圧力の確認]をクリックして、押し出し 圧力 を調整できるようにします。 適切な圧力(希望の解像度に応じて~30-120 kPa )を選択したら、以前に生成された Gコード を開き、[ 実行 ]をクリックして印刷プロセスを開始します。 5.皮膚類似体の調製 ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)および脂肪由来幹細胞(ADSC)を、ウシ胎児血清(FBS)(10%)、HEPESバッファー(2.5%)、およびペニシリン/ストレプトマイシン(1%)を添加したDMEMでT75フラスコで、90%のコンフルエントに達するまで培養します。ヒト表皮角化細胞(HEK)をケラチノサイト増殖培地(KGM)中で70%〜80%のコンフルエントに達するまで培養する。培養中は、インキュベーター内ですべての細胞を37°C、5%CO2、および95%空気の条件下で保持します。 皮膚および脂肪バイオインク用のHDFおよびADSCを調製するには、3 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をフラスコに穏やかにピペッティングして細胞を洗浄し、フラスコを傾けてPBSを細胞上で旋回させ、付着した細胞を乱さないように注意しながら吸引します。細胞を持ち上げるには、1x細胞解離酵素3 mLをフラスコにピペットで入れて細胞を覆い、フラスコをインキュベーターに3分間置き、フラスコを手のひらにしっかりと叩いて細胞を取り除きます。6mLの完全なDMEMを使用して酵素の作用を中和します。注:タップ後も細胞が付着したままの場合は、さらに2分間インキュベートします。 皮膚および脂肪バイオインクの調製には、細胞懸濁液を別々の15 mLチューブにピペットで入れ、血球計算盤を使用して細胞計数するためにそれぞれから10 μLを採取します。残りの細胞懸濁液を300 × g で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。 ペレットを乱さないように注意しながら上清を吸引し、適切なポリマー溶液(ステップ2.2で調製)を加え、次の密度でピペッティングして穏やかな刺激を使用して混合します。脂肪層には、コラーゲンとペクチンのブレンドを1:1あたり5×105 ADSCsmL-1でピペットします。 乳頭層には、ピペット3×106 HDF mL-1 あたり2:1コラーゲンとペクチンブレンド。 網状層には、コラーゲンとペクチンをブレンドしたコラーゲン1.5×106 HDF mL-1 をピペットでピペットします。 印刷するには、各バイオインクを別々のカートリッジに入れ、セクション4の指示に従って、ガラスペトリ皿の支持流体ゲルにコンストラクトを印刷します。印刷が完了したら、シリンジと針を使用して、コンストラクトの周りに2 mLの200 mM CaCl 2∙2H2 Oと3 mLの脂肪生成培地(500 μMイソブチルメチルキサンチン[IBMX]、50 μMインドメタシン、および1 μMデキサメタゾンを添加した完全なDMEM)を流体ゲルに注入します。インキュベーターに一晩入れます。 翌日、スパチュラを用いてコンストラクトをサポートバスから取り出し、PBSで穏やかに洗浄し、6ウェルプレート中の脂肪生成培地中で14日間培養した。 14日後、コンストラクトの表面に気液界面を形成するのに十分な培地を除去し、コンストラクトの上に2×10個の6個の ケラチノサイトを播種して表皮層を作成する。 分析前にさらに1週間培養する。 6. 頸動脈モデルの作製 ジェランガムバイオインク溶液(手順2.1で調製)をプリンターカートリッジに入れます。 セクション4の印刷手順に従って、流体ゲルサポート材料を含むペトリ皿内の頸動脈モデルを印刷します。 印刷が完了したら、シリンジと針を使用して、2 mLの200 mM CaCl 2∙2H2Oをコンストラクトの周りに注入します。 最低3時間後、スパチュラを使用してサポートバスからコンストラクトを取り出し、PBSで静かに洗浄します。