JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Askıda 3D biyobaskı için jelasyon sırasında kesme işlemi ile oluşturulan agaroz sıvı jelleri

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/64458
, , , , ,
1Department of Pharmacy,University of Huddersfield, 2School of Chemical Engineering,University of Birmingham, 3Chemical and Biological Engineering,University of Colorado Boulder, 4School of Biological Sciences,University of Manchester

Summary

Hidrojel oluşumu sırasında kesme işlemi, kesme kuvvetlerinin giderilmesini takiben kesme inceliğinde ancak hızla yeniden yapılandırılan mikrojel süspansiyonlarının üretilmesiyle sonuçlanır. Bu tür malzemeler, biyobaskı kompleksi, hücre yüklü yapılar için destekleyici bir matris olarak kullanılmıştır. Burada, destekleyici yatağın ve uyumlu biyomürekkeplerin üretiminde kullanılan yöntemler açıklanmaktadır.

Abstract

Biyobaskı işlemi sırasında parçaları desteklemek için granüler matrislerin kullanımı ilk olarak 2015 yılında Bhattacharjee ve ark. tarafından bildirilmiştir ve o zamandan beri, 3D biyobaskıda destekleyici jel yataklarının hazırlanması ve kullanılması için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu makalede, agaroz (sıvı jeller olarak bilinir) kullanılarak mikrojel süspansiyonları üretmek için bir süreç açıklanmaktadır; burada partikül oluşumu, jelasyon sırasında kesme uygulaması ile yönetilir. Bu tür bir işlem, hem kimyasal hem de mekanik olarak baskı ortamının gömülmesi gibi belirgin avantajlar sağlayan müteakip malzeme özellikleri ile dikkatlice tanımlanmış mikroyapılar üretir. Bunlar, sıfır kaymada viskoelastik katı benzeri malzemeler gibi davranmayı, uzun menzilli difüzyonu sınırlamayı ve topaklanmış sistemlerin karakteristik kesme inceltme davranışını göstermeyi içerir.

Bununla birlikte, kayma gerilmesinin giderilmesinde, sıvı jeller elastik özelliklerini hızla geri kazanma kapasitesine sahiptir. Bu histerezis eksikliği, daha önce ima edilen tanımlanmış mikro yapılarla doğrudan bağlantılıdır; İşleme nedeniyle, parçacık arayüzündeki reaktif, jelleşmemiş polimer zincirleri, Velcro etkisine benzer şekilde parçacıklar arası etkileşimleri kolaylaştırır. Elastik özelliklerin bu hızlı geri kazanımı, düşük viskoziteli biyomalzemelerden yüksek çözünürlüklü parçaların biyo-baskısını mümkün kılar, çünkü destek yatağının hızlı reformasyonu biyomürekkebi in situ olarak yakalar ve şeklini korur. Ayrıca, agaroz sıvı jellerinin bir avantajı asimetrik jelleşme / erime geçişleridir (~ 30 ° C jelasyon sıcaklığı ve ~ 90 ° C erime sıcaklığı). Agarozun bu termal histerezisi, destekleyici sıvı jel erimesi olmadan biyobaskılı parçanın yerinde basılmasını ve kültürlenmesini mümkün kılar. Bu protokol, agaroz sıvı jellerinin nasıl üretileceğini gösterir ve asılı katmanlı katkı maddesi üretimi (SLAM) içinde bir dizi karmaşık hidrojel parçasının üretimini desteklemek için kullanımlarını gösterir.

Introduction

Hidrojeller, hücre büyümesi için destek olarak kullanmak için mükemmel malzemelerdir1. Kullanılan malzemeye bağlı olarak, hücre canlılığından ödün vermeyen nazik mekanizmalarla jelleşirler 2,3. Yüksek su içeriği (tipik olarak %>90), besin maddelerinin ve oksijenin malzemeye kolayca yayılabileceği ve hücre metabolizmasının atıkürünlerinin 4. Bu nedenle, hücre canlılığının 1 yıl5’i aşan süreler boyunca korunduğu gösterilmiştir ve şimdi gelecekteki terapötik kullanım için hücreleri depolamak veya “duraklatmak” için kullanılan hidrojel örnekleri vardır6. Doku mühendisliğinde doku benzeri yapıların üretimi için yaygın olarak kullanılmaktadırlar, ancak kullanımları, malzemenin hem yapısını hem de bileşimini kontrol etmedeki zorlukla sınırlı olma eğilimindedir. Tarihsel olarak, hidrojel mukavemeti, yapıyı oluşturan polimer matrisi tarafından işgal edilen yüksek su içeriği ve düşük hacimler nedeniyle nispeten düşüktür (birçok sert dokuya göre). Ayrıca, jelasyona giden birçok yol (termal, iyonotropik, fibrillogenez) oldukça yavaş kinetik sunar, yani mekanik özellikleri zamanla istikrarlı bir şekilde gelişme eğilimindedir. Birbirine nüfuz eden ağlar hariç, düşük mekanik sertlik ve yavaş kürlenme süreleri genellikle biriktirme üzerinde serbest duramayan, “çökme” eğiliminde olan ve başlangıçta ekstrüde edildiğinde tanımını kaybeden biyomürekkeplere neden olur.

Bu önemli sorunun üstesinden gelmek amacıyla, baskı sırasında destek sağlayan gömülü baskı teknikleri geliştirilirken, yapının mekanik özellikleri 7,8 gelişmektedir. Jelin mikroyapısı tamamen geliştikten ve mekanik özellikler optimum seviyeye ulaştığında, destek matrisi, tipik olarak destek fazının nazikçe yıkanması veya eritilmesiyle çıkarılabilir. Bu yaklaşımdaki ilk çalışmalar, ikincil fazın dağıtıldığı viskoz bir pluronik dispersiyon kullandı9. Daha yakın zamanlarda, Bhattacharjee ve ark., destekleyici jel10’da hücre dizilerinin askıya alınabileceğini göstermek için granüle karbopol formunda jeller kullandılar. Daha sonra, Hinton ve ark., hücreleri içeren jel bazlı malzemelerin, granül jelatin11’den oluşan bir mikrojel süspansiyonundan oluşan bir destek yatağına ekstrüzyonunu bildirmiştir. Hücre içeren hidrojelin ekstrüzyonu ve ardından kürlenmesinden sonra, jelatin, destek banyosunun hafifçe ısıtılmasıyla jelatinin erimesini sağlayarak uzaklaştırıldı. Ne yazık ki, bu süreç hala birkaç sınırlama sunmaktadır. Örneğin, jelatinin kollajenle karşılaştırıldığında kimyasal yapısı (sonuç olarak hidrolize bir kollajen formu olması), omurgasındaki birçok kimyasal parçanın biyolojik varlıklarla etkileşime girebileceği şekildedir; Bu nedenle, artık bir destek matrisi aşağı akış biyolojik süreçlerine müdahale edebilir. Dahası, hayvansal kaynaklı ürünler, bir teknolojinin çevrilebilirliğine bakarken kısıtlayıcı kullanım sağlar. Bu, üretilen parçanın klinik olarak kullanılması amaçlanıyorsa veya bu yüzey kontaminasyonunun önemli bir soruna neden olabileceği temel biyolojik soruları cevaplamak için kullanılacaksa bile zorluklar yaratır.

Daha sonra, destekleyici bir matris içinde, fizyolojik koşullar altında hiçbir yükü olmayan ve hayvansal olmayan malzemelerden oluşan hidrojellerin askıya alınmış üretimine izin veren rafine bir süreç yarattık. İşlem bir dizi biyopolimerik destekle kullanılabilmesine rağmen, agaroz, şeker bazlı olduğu ve fizyolojik pH12,13’te nötr olarak yüklendiği için biyolojik etkileşimlere karşı inert bir malzeme sağlar. Mevcut bir jeli parçalamak yerine, destek malzemesi jelasyon 14,15,16 sırasında makas uygulanmasıyla oluşturulur. Bu, yüzeylerinde dendron benzeri özellikler sergileyen ve jelleşmemiş polimer17,18’in ikincil bir matrisinde dağılan bir parçacık matrisi üretir. Sonuç, daha önce bildirilen granüler jellere benzer şekilde ince kesebilen, ancak kesme çıkarıldığında viskoziteyi daha hızlı geri kazanma eğiliminde olan, ilginç malzeme özelliklerine sahip 19,20,21,22 bir malzemedir 23. Destek matrisine ekstrüde edilen hücre taşıyan malzeme tamamen olgunlaştıktan sonra, destek matrisi kültüre yerleştirilmeden önce hafif ajitasyon yoluyla çıkarılabilir. Bu işlemin karmaşık yapılara sahip malzemeler üretmek ve hem cildin hem de osteokondral bölgenin biyolojik yapılarını özetlemek için kullanılmasının mümkün olduğu gösterilmiştir23,24,25. Bu yöntem belgesi, destekleyici malzemenin nasıl üretileceğini ayrıntılı olarak açıklamakta ve çeşitli karmaşık yapılarda kullanılan uygun biyomürekkepleri vurgulamaktadır.

Protocol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler, ekipman ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. 1. Sıvı jel süspansiyon yatağının hazırlanması 2.000 mL’lik bir cam şişede 1.000 mL ultra saf suya (Tip 1, >18 mΩ·cm-1) 5 g agaroz tozu ekleyerek 1.000 mL dağınık agaroz (%0,5 w/v) hazırlayın. Sulu karışıma 70 mm’lik bir manyetik karıştırıcı çubuk ekleyin ve şişe kapağını önce tamamen sıkarak ve sonra çeyrek tur gevşeterek sabitleyin. Cam şişeyi otoklavın sepetine yerleştirerek, kapağı kapatarak ve 121 ° C ve 1 Bar’da 15 dakika boyunca bir döngü çalıştırarak karışımı çözün ve sterilize edin.NOT: Bu protokol her zaman sonraki adımlarda çözeltileri otoklavlamak için kullanılır. Otoklav 80 ° C’ye soğuduktan sonra şişeyi otoklavdan çıkarın ve karıştırma 800 rpm’ye ayarlanmış şekilde manyetik bir karıştırıcıya (ısıtılmamış) yerleştirin.DİKKAT: Şişe ve sıvı sıcak kalır. Ortam koşulları altında, sürekli karıştırmayı sürdürürken, sıcaklık Tjelinden (jelleşme noktası), 32 ° C’den daha düşük olana kadar sol’u soğutun. Şişeyi karıştırıcıdan çıkarın ve 4 ° C’de saklayın.NOT: Sıvı jel ihtiyaç duyulana kadar saklanabilir. 2. Bioinklerin hazırlanması Ultra saf suda %1 (w/w) düşük açil jel sakızı (Tip 1, >18 mΩ·cm-1) sol kullanarak jellan bazlı bir biyomürekkep hazırlayın.Bir tartım teknesine 0,5 g jellan tozu tartın. Manyetik bir karıştırıcı ile birlikte 100 mL’lik bir cam şişeye 49,5 g ultra saf su ekleyin. Jellan gücü içeren tartım teknesini ikiye katlayın ve sürekli karıştırırken tozu yavaşça suya ekleyin. Sol’u bir otoklav kullanarak çözün ve sterilize edin ve 20 ° C’ye soğumasını bekleyin. Biyomürekkebi bir sonraki kullanıma kadar 4 °C’de saklayın. Ultra saf suda pektin-kollajen karışımlı bir biyomürekkep hazırlayın (Tip 1, >18 mΩ · cm-1).Bir tartım teknesine 2,5 g pektin tozu tartarak stok %5 (w/v) düşük metoksi pektin çözeltileri hazırlayın. Manyetik bir karıştırıcı ile birlikte 100 mL’lik bir cam şişeye 50 mL ultra saf su ekleyin. Pektin gücü içeren tartım teknesini ikiye katlayın ve sürekli karıştırırken tozu yavaşça suya ekleyin. Sulu karışımı otoklavlayın ve 20 ° C’ye soğutun. 3 mL kollajen çözeltisine 3 mL pektin çözeltisi ekleyerek veya sırasıyla 2 mL kollajen çözeltisine 4 mL pektin çözeltisi ekleyerek 1:1 ve 2:1 pektin-kollajen karışımları hazırlayın. Karışımı 10x çekip dağıtarak bir pipet kullanarak karışımları yavaşça karıştırın.NOT: Bu prosedür, kollajenin erken jelleşmesini önlemek için buz üzerinde soğuk malzemeler kullanılarak en iyi şekilde gerçekleştirilir. Pektin ve kollajenin ön soğutması, karıştırmadan önce 4 ° C’de saklanarak sağlanabilir. Daha sonraki kullanıma kadar 4 °C’de saklayın. Ultra saf suda aljinat-kollajen karışımlı bir biyomürekkep hazırlayın (Tip 1, >18 mΩ · cm-1).Bir tartım teknesine 2 g aljinat tozu tartın. Manyetik bir karıştırıcı ile birlikte 100 mL’lik bir cam şişeye 50 mL ultra saf su ekleyin. Aljinat gücü içeren tartım teknesini ikiye katlayın ve sürekli karıştırırken tozu yavaşça suya ekleyin. Aljinat tamamen çözünene kadar (berrak, hafif kahverengi sıvı) sürekli karıştırma altında dispersiyonu 60 ° C’ye ısıtın ve ardından 20 ° C’ye soğutun. Aljinat çözeltisini, 25 mL DMEM’e 25 mL aljinat çözeltisi ekleyerek Dulbecco’nun modifiye kartal besiyeri (DMEM) gibi hücre kültürü ortamı ile seyreltin. 3 mL kollajen çözeltisine 3 mL aljinat/DMEM çözeltisi ekleyerek aljinat-kollajen karışımları (1:1) hazırlayın. Karışımı 10 kat çekip dağıtarak bir pipet kullanarak karışımları yavaşça karıştırın ve 4 °C’de saklayın.NOT: Bu prosedür, kollajenin erken jelleşmesini önlemek için buz üzerinde soğuk malzemeler kullanılarak en iyi şekilde gerçekleştirilir. Pektin ve kollajenin ön soğutması, karıştırmadan önce 4 ° C’de saklanarak sağlanabilir. 3. Biyomürekkeplerin reolojik karakterizasyonu Reometreyi açın, 40 mm tırtıklı geometriler yerleştirin ve 30 dakika bekletin. Sıfır boşluk yüksekliği işlevini kullanarak reometrenin boşluk yüksekliğini sıfırlayın. Alt plakaya ~2 mL numune ekleyin ve 1 mm’lik bir boşluk yüksekliği oluşturmak için üst geometriyi alçaltın. Plakaların arasından atılan fazla malzemeyi çıkararak numuneyi kesin. Bunu yapmak için, fazla sıvıyı boşluktan uzaklaştırmak ve kağıt mendille ıslatmak için düz, aşındırıcı olmayan bir kenar kullanın.NOT: Aşağıdaki adımların her birinden önce örneği değiştirmek için 3.2-3.4 arası adımlar yinelenir. Biyomürekkebin enjekte edilebilirliğini belirlemek için viskozimetri profilleri üstlenin.Kullanıcı seçeneklerinden viskozitri testini seçin. Kesme hızı kontrollü rampa testi için parametreleri girin: 1 dakikalık rampa süresiyle 0,1 ila 500 s-1. Adım 3.5.2’deki kesme hızı kontrollü rampa testinden belirlenen üst ve alt gerilimleri kullanarak, stres kontrolü altındaki yeni numunelerde viskozitri rampa testini tekrarlayın. Bioink’in jelleşme özelliklerini belirlemek için küçük deformasyon testleri yapın.Kullanıcı seçeneklerinden salınımlı testi seçin. Sabit gerinim altında tek bir frekans testine parametreleri girin: frekans 1 Hz, mürekkep jelleri iken 1 saat içinde %0,5 gerinim. Jelleştirilmiş numuneler üzerinde in situ genlik ve frekans ölçümleri yapın.Kullanıcı seçeneklerinden salınımlı testi seçin. Genlik süpürmeyi seçin ve gerinim kontrollü bir genlik süpürme testi için parametreleri girin: sabit 1 Hz frekansında% 0,01 ila% 500. Yeni bir numune yükleyin ve kullanıcı seçeneklerinden salınımlı testi seçin. Ardından, frekans testini ve 0,01 ile 10 Hz arasındaki giriş frekansı parametrelerini ve adım 3.7.2’de elde edilen genlik süpürme verilerinden belirlenen spektrumun doğrusal viskoelastik bölgesi (LVR) içindeki bir gerinim seçin (tipik olarak LVR’nin% 50 ila% 80’i arasında bir değer). 4. 3D biyoyazıcı kullanarak 3D yapıların tasarlanması ve yazdırılması CAD modeli oluşturmaya başlamak için CAD Yazılımını başlatın.Araçları Seçin | Seçilen biyomürekkep için baskı parametrelerini tanımlamak için CAD yazılımındaki malzemeler. Kullanılan yazıcıyla ilgili yazdırma parametrelerini girin; örneğin, 3B Keşif için, her katmanın Z kalınlığını belirlemek üzere kalınlık sekmesine tahmini filament çapını (çoğu biyomürekkep için ~200-500 μm) girin.NOT: Son yapının delaminasyonu, kalınlık değerini artırma ihtiyacının göstergesidir, çözünürlük kaybı ise kalınlığın azaltılması ihtiyacını vurgulamaktadır. Yazılımdaki Katman sekmelerini kullanarak istediğiniz yapıyı katman katman tasarlayın. Grup sekmesini kullanarak katmanları gruplandırın ve Düzey sekmesini kullanarak her katmanı Z düzleminde bir düzeye atayın.Örneğin, bir kafes yapısı oluşturmak için (adım 2.3’te hazırlanan aljinat-kollajen karışımlı bir biyomürekkep kullanarak), x ekseni boyunca filamentlerle bir katman ve y ekseni boyunca filamentlerle ikinci bir katman oluşturun. Her ikisini de ayrı bir Düzeye atayın. Grup sekmesi altında, yapıdaki yinelenen birimlerin sayısını seçerek yapı yüksekliğini belirleyin. Tasarım için bir G kodu oluşturmak ve yapının 3B görüntüsünü görüntülemek için Oluştur aracını tıklatın. BioCAD’i kapatın ve baskı işlemini başlatmak için 3D Discovery insan-makine arayüzü (HMI) yazılımını başlatın.Yazıcı kafasını üreticinin talimatlarına göre monte edin. Mikrovalfi yazıcı kafasına monte edin ve seçilen ekstrüzyon nozuluna vidalayın. Yazıcı kafasını kalibre etmek için İğne Uzunluğu Ölçümü işlevini tıklatın. Baskı platformuna bir kültür kabı (örneğin, 6 delikli bir plaka) yükleyin. Bioink’i baskı kartuşuna takın ve mikro valfin üzerindeki yazıcı kafasına vidalayın. Monte edilmiş yazıcı kafasını pnömatik basınç sistemine bağlayın ve devreye girmek için HMI’daki yazıcı kafasını seçin. Ekstrüzyon basıncının ayarlanmasına izin vermek için basıncı kontrol et’e tıklayın. Uygun bir basınç seçildikten sonra (istenen çözünürlüğe bağlı olarak ~ 30-120 kPa ), daha önce oluşturulan G kodunu açın ve yazdırma işlemini başlatmak için Çalıştır’ı tıklatın. 5. Cilt analoglarının hazırlanması DMEM’deki kültür insan dermal fibroblastları (HDF’ler) ve adipoz kaynaklı kök hücreler (ADSC’ler), T75 şişelerinde fetal sığır serumu (FBS) (% 10), HEPES tamponu (% 2.5) ve penisilin / streptomisin (% 1) ile desteklenerek% 90 akıcılığa ulaşılana kadar. Kültür insan epidermal keratinositleri (HEK’ler) keratinosit büyüme ortamında (KGM) -80 oranında akıcılığa ulaşana kadar. Tüm hücreleri 37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 hava koşullarında bir inkübatörde tutun. Dermal ve adipoz biyomürekkepler için HDF’lerin ve ADSC’lerin hazırlanması için, 3 mL fosfat tamponlu salin (PBS) şişelere hafifçe pipetleyerek hücreleri yıkayın, PBS’yi hücrelerin üzerinde döndürmek için şişeyi eğin ve ekli hücreleri rahatsız etmemeye özen göstererek aspire edin.Hücreleri kaldırmak için, hücreleri örtmek için şişeye 3 mL 1x hücre ayrışma enzimi pipeti yerleştirin ve şişeyi 3 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin, şişeyi hücreleri yerinden çıkarmak için elin avucuna sıkıca vurun. 6 mL tam DMEM kullanarak enzimin etkisini nötralize edin.NOT: Dokunduktan sonra hücreler bağlı kalırsa 2 dakika daha inkübe edin. Dermal ve adipoz biyomürekkeplerin hazırlanması için, hücre süspansiyonlarını ayrı 15 mL tüplere pipet edin ve bir hemositometre kullanarak hücre sayımı için her birinden 10 μL alın. Hücreleri pelet haline getirmek için kalan hücre süspansiyonlarını 5 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj edin. Peletin rahatsız edilmemesine dikkat ederek süpernatanı aspire edin, uygun polimer çözeltisini ekleyin (adım 2.2’de hazırlanmıştır) ve aşağıdaki yoğunluklarda pipetleme yaparak hafif stimülasyon kullanarak karıştırın:Yağ tabakası için, pipet 5 × 105 ADSCs mL-1 başına 1:1 kollajen başına pektin karışımı. Papiller tabaka için, pipet 3 × 106 HDF, pektin karışımına 2:1 kollajen başına mL-1 . Retiküler tabaka için, pipet 1.5 × 106 HDFs mL-1 başına 2: 1 kollajen başına pektin karışımı. Yazdırmak için, her bir biyomürekkebi ayrı bir kartuşa takın ve yapıyı bölüm 4’teki talimatlara göre bir cam Petri kabındaki destekleyici sıvı jeline yazdırın.Baskı tamamlandıktan sonra, bir şırınga ve iğne kullanarak sıvı jele yapı etrafında 2 mL 200 mM CaCl2∙2H2 O ve 3 mL adipojenik ortam (500 μM izobütil-metilksantin [IBMX], 50 μM indometasin ve 1 μM deksametazon ile desteklenmiş tam DMEM) enjekte edin. Gece boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, yapıyı bir spatula kullanarak destek banyosundan çıkarın, PBS’de nazikçe yıkayın ve 6 delikli bir plakada adipojenik ortamda 14 gün boyunca kültürleyin. 14 gün sonra, yapının yüzeyinde bir hava-sıvı arayüzü oluşturmak için yeterli ortamı çıkarın ve epidermal bir tabaka oluşturmak için yapının üzerine 2 × 106 keratinosit tohumlayın. Analizden önce 1 hafta boyunca daha fazla kültür. 6. Karotis arter modelinin hazırlanması Gellan sakız biyomürekkep çözeltisini (adım 2.1’de hazırlandığı gibi) bir yazıcı kartuşuna takın. Karotis arter modelini, sıvı jel destek malzemesini içeren bir Petri kabı içinde, bölüm 4’teki yazdırma talimatlarına göre yazdırın. Baskı tamamlandıktan sonra, bir şırınga ve iğne kullanarak yapının etrafına 2 mL 200 mM CaCl 2∙2H2 O enjekte edin. En az 3 saat sonra, yapıyı bir spatula kullanarak destek banyosundan çıkarın ve PBS’de hafifçe yıkayın.

Representative Results

Aljinat ve tip I kollajen biyomürekkebiBaskı çözünürlüğünün (filament çapının bir fonksiyonu olarak kaydedilen) ekstrüzyon basıncındaki değişikliklerle doğrudan ayarlanabilir olduğu gözlenmiştir (Şekil 1A-C). Ekstrüzyon basıncı ve baskı çözünürlüğü, 30 kPa’lık bir ekstrüzyon basıncında baskı yoluyla üretilen en küçük filament çaplarıyla doğrudan ilişkiliydi. İlginç bir şekilde, 30 kPa’lık bir ekstrüzyon basıncında, ekstrüzyon nozulunun iç çapına uyan filamentler üretilebilir (ortalama filament çapı: 323 μm ± 50 μm; nozul çapı: 300 μm), bu da “maksimum çözünürlük” elde edilebileceğini düşündürür. Ayrıca, bu çözünürlük için baskı parametreleri, ekstrakte edilebilen ve perfüze edilebilen bir aljinat/kollajen vasküler tüpün oluşumuna başarıyla uygulanabilir (Şekil 1D). Şekil 1: SLAM kullanarak yüksek çözünürlüklü baskılar oluşturma. Aljinat/kollajen kafeslerin baskı çözünürlüğünün (A) 30 kPa, (B) 60 kPa ve (C) 120 kPa’da ekstrüzyon yoluyla filament çapının bir fonksiyonu olarak uyarlanması. (D) Bir aljinat/kollajen vasküler tüpün oluşturulması. Ölçek çubukları = 400 μm (A-C), 10 mm (D). Kısaltma: SLAM = askıda katmanlı katkı maddesi üretimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Cilt analoglarıSLAM ayrıca kollajen I ve pektin karışımından oluşan bir biyomürekkep kullanarak cilt benzeri bir yapı oluşturmak için kullanıldı (Şekil 2A). Deride bulunanlara benzer mekanik özelliklerin bir gradyanını elde etmek için, dermal (2: 1’de 5 mg∙mL−1 kollajen stoğu ile karıştırılmış% 5 w / w pektin) ve hipodermal (5 mg ∙mL − 1 kollajen stoğu ile 1: 1’de karıştırılmış% 5 w / w pektin) katmanlarında farklı oranlarda pektin ve kollajen kullanılmıştır. Ortaya çıkan yapı (Şekil 2Bi-Bii), DMEM’e daldırıldıktan sonra, delaminasyon belirtisi olmadan iyi bir şekilde entegre edilmiştir. Önemli olarak, 14 günlük bir kültür periyodunu takiben yapı boyunca yüksek düzeyde hücre canlılığı vardı (Şekil 2Biii). İlginç bir şekilde, kültür döneminde, malzemeler24’ü sertleştirdi ve bu da malzemenin yeniden şekillendiğini gösterdi. Şekil 2: Cilt benzeri bir yapının üretimi. (A) SLAM işleminin insan dermal fibroblastları ile gömülü katmanlı bir yapı üretmek için nasıl kullanıldığını gösteren bir şema. Buradaki askı yatağı agarozdan oluşan parçacıklardan üretilirken, hipodermal ve dermal tabakalar değişen oranlarda pektin ve kollajen I’den oluşuyordu. (B) Katmanlı yapının cildin üç katmanlı yapısını temsil etmesi amaçlanmıştır (i). Bu yapının çoğaltılmasında başarı ile (ii), kalsein-boyama (iii) ile gösterildiği gibi, numuneler boyunca yüksek düzeyde hücre canlılığı kaydedilmiştir. Ölçek çubuğu = 5 mm (Bii). Kısaltma: SLAM = askıda katmanlı katkı maddesi üretimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şah damarıYöntemin sınırlarını zorlamak için, daha karmaşık baskılardan oluşan bir seçim üretildi. Böyle bir örnekte, bifurkasyonlu bir karotis arter% 1 jel biyomürekkebi kullanılarak basılmıştır (Şekil 3A), daha sonra sıvı jel yatağı içinde 200 mM CaCl2’nin ekstrüzyonu ile çapraz bağlanmıştır (Şekil 3B) ve jelleşmeyi takiben destekten basitçe kaldırılmıştır (Şekil 3C). Düşük viskozite sergileyen öncü baskı çözümlerine rağmen, destek yatağı karmaşık geometrinin üretimini sağlamada başarılı oldu. Arter, biriktirme, çapraz bağlama ve ekstraksiyon sırasında (Şekil 3), ek iskele eklemek için baskı kodlarını değiştirmeye gerek kalmadan yapısını korumuştur. Şekil 3: Gellan karotis arterin SLAM kullanılarak üretim süreci . (A) Baskı sırasında sıvı jel yatağı içinde jellanın ekstrüzyonu, (B) çapraz bağlama sırasında sıvı jel içinde tamamlanmış karotis arter baskısı ve (C) sıvı jel desteğinden alındıktan sonra nihai karotis arter modeli. Ölçek çubukları = 10 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Destek yatağı için kullanılan malzemelerin seçiminin dikkate alınması
Geliştirme aşamasında, destek yatağından istenen çeşitli özellikler vardı. Bu özellikler şunları içeriyordu: i) ekstrüde edilmiş malzemeyi askıya almak için yeterli yapının korunması; ii) yazıcı kafasının destekleyici malzeme içinde serbestçe hareket etmesini sağlamak için kesme inceltme kapasitesi; iii) biriken biyomürekkebin etrafında destek oluşturan hızlı yeniden yapılanma (kendi kendini iyileştirme özellikleri); iv) Hem oda sıcaklığında hem de fizyolojik sıcaklıklarda termal olarak kararlı; v) Bir dizi pH ve elektrolit (iyonik türler ve konsantrasyonlar) boyunca nispeten biyoinert olan, hücreler ve yüklü biyomürekkeplerle etkileşimi önleyen nötr (yani yüksüz) malzeme; vi) toksik olmayan; ve, vii) tercihen hayvansal olmayan bir kaynaktan.

Bu doğal özelliklerin birçoğunu koruyan, tüm bu özelliklere uymadan askıya alınmış 3D katkı maddesi üretimi gerçekleştirme kapasitesine sahip birçok biyopolimer malzeme olmasına rağmen 11,26,27, buradaki amaç, diğer destekleyici malzemelerle ilişkili bazı pratik sorunların üstesinden gelecek bir destekleyici yatak üretmekti. Agarozun kimyasal özellikleri nedeniyle ve özellikle partikül sıvı jeli olarak formüle edildiğinde, tüm bu özellikler elde edilebilir. Bu, çok çeşitli biyomürekkeplerde kullanılabilecek bir destek yatağı sağladı23,24,25,28. Gerçekten de, malzemenin biyoinert doğası, kültür boyunca basılı yapıyı yerinde tutma potansiyeli sağladı ve biyolojide değişiklik yapmadan birçok farklı biyomürekkebin tamamen gelişmesi için yeterli zaman ölçeklerine izin verdi. Ayrıca, partikül, inceltici doğa, nihai basılı yapıdan çıkarma kolaylığı sağlarken, toksik olmayan, hayvansal kökenli olmayan, etik ve düzenleyici gerekliliklerle ilgili engellerin üstesinden gelerek kliniğe doğru hızlı çeviri potansiyeline izin verir.

Biyomürekkepler için malzeme seçiminde dikkat edilmesi gerekenler
Doğrudan ekstrüzyon biyobaskıda, biyomürekkepler bir 2D baskı yatağına biriktirilir. Monomer biyomürekkep çözeltilerinin kesme inceltme davranışına sahip olması faydalıdır; Bununla birlikte, fizyolojik olarak ilgili boyutlara sahip yüksek doğruluklu yapılar üretmek için, düşük tiksotropiye sahip olmaları ve yeterince yüksek viskozitelere geri dönmeleri gerekir, böylece 29,30,31 biriktiğinde katı filamentler oluştururlar. Artan viskozite ile, ekstrüzyon için gereken basınç çok daha yüksektir ve genellikle kapsüllenmiş hücre canlılığını olumsuz yönde etkiler31,32. Ekstrüde edilmiş malzeme çapraz bağlama boyunca süspansiyon banyosu tarafından desteklendiği için süspansiyon biyobaskısı bu sınırlamayı ortadan kaldırır. Bu gelişme, kullanılabilecek biyomürekkep formülasyonlarının çeşitliliğini büyük ölçüde artırmaktadır. Örneğin, son zamanlarda yapılan çalışmalar, düşük konsantrasyonlu kollajen çözeltilerinin kalbin iç yapısına benzer şekilde oldukça karmaşık geometrilere basıldığını göstermiştir33,34,35. Bu yöntemde bahsedilen uygulamalarda, gömülü baskı, biyomalzeme mürekkeplerinin, basılma yetenekleri yerine, amaçlandıkları fizyolojik ortamı en iyi şekilde çoğaltmak için seçilmesine izin verdi.

Yapı boyutundaki sınırlamalar
Biyofabrikasyon literatürü boyunca, alternatif yazıcı kafası teknolojileri tarafından yönlendirilen farklı biyoyazıcı türlerinin gömülü üretim tekniklerine dahil edilebileceği gösterilmiştir. Burada gösterilen teknoloji, Senior ve ark. tarafından gösterildiği gibi pnömatik mikro-ekstrüzyon tabanlı biyoyazıcı (INKREDIBLE) ve kontrol edilebilir mikrovalflere sahip ekstrüzyon tabanlı biyoyazıcılar (3D Discovery)23 içeren örneklerle farklı değildir. Bu, teknolojiyi zaten bir biyoyazıcıya sahip olabilecek bir dizi kullanıcı için erişilebilir kılsa da, yapının ulaşılabilir boyutundaki sınırlamalar sonuçta söz konusu biyoyazıcı özelliklerine bağlıdır. Başlangıçta, büyük yapıların oluşumu üzerindeki ana kısıtlama, baskı yatağının boyutu, X, Y ve Z yörüngelerinin sınırları ve ayrıca destekleyici sıvı jelinin bulunduğu kabın büyüklüğü ile tanımlanır.

Çözünürlükteki sınırlamalar
Karmaşık, mikrometre boyutlu yapılar üretilirken, ortaya çıkan çözünürlük büyük ölçüde yazıcının hassasiyetine (adım boyutu, ekstrüzyon derecesi üzerinde kontrol), baskı nozulunun iç çapına ve baskı hızı, baskı basıncı ve akış hızı36 dahil olmak üzere bir dizi ayarlanabilir yazılım parametresine bağlıdır. Ek olarak, damlacık boyutu üzerindeki kontrol, yüksek çözünürlüklü yapıların oluşturulmasını kolaylaştırmak için kritik öneme sahip gibi görünmektedir ve en iyi sonuçlar, kontrol edilebilir bir mikrovalfe sahip ekstrüzyon yazıcılarında gözlemlenmiştir. Nihayetinde, tüm parametreler optimize edildiğinde, ekstrüzyon nozullarının iç çapıyla eşleşecek veya hatta daha küçük olacak baskı çözünürlükleri, mikrometre ölçeği37 sırasına göre biriken filamentle elde edilebilir. Bununla birlikte, bu, daha önce bahsedilen tüm baskı parametrelerinin optimizasyonuna bağlıdır ve çözünürlük, baskı mekanizması ve hassasiyeti ile önemli ölçüde sınırlandırılabilir. Örneğin, pnömatik ekstrüzyon, kontrol edilebilir bir mikrovalf ile ekstrüzyon ile aynı baskı çözünürlüğüne izin vermiyor gibi görünmektedir. Bu nedenle, maksimum baskı çözünürlüğünü elde etmek için potansiyel bir maliyet etkisi vardır, çünkü bu tür sistemler kullanıcı için önemli ölçüde artan bir masrafa neden olur.

Geleceğe bakış açısı ve potansiyel
Şu anda, gömülü hücreler içeren karmaşık yumuşak yapıların üretimine izin vermek için askıya alınmış üretim süreçlerinin kullanımına çok fazla ilgi var ve şüphesiz önümüzdeki yıllarda önemli ilerlemeler olacak. Baskı çözünürlüğünün iyileştirilmesinde sürekli ilerleme sağlanmıştır, ancak biyolojik sistemlerin çoğunun kendilerini moleküler düzeyde yeniden düzenleyebildikleri göz önüne alındığında, bunun ne kadar gerekli olacağı görülecektir. Medyadaki ilgi odağı, yaralanma veya hastalıktan sonra insan dokularını doğrudan değiştirmek için 3D baskılı dokuların kullanımı etrafında olsa da, bu süreçlerin sağladığı sağlam tıbbi prosedürler birkaç yıl uzaktadır38,39. Bu karmaşık kültür sistemlerinin etkisinin, biyolojik süreçler hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için ilaçların taranmasında veya hatta araç olarak kullanılmasında olması daha olasıdır38. Özellikle, gelişimsel biyoloji, moleküllerin özel birikimi üzerindeki hassas kontrolün, araştırmacıların çok faktörlü sistemlerin doku gelişim süreçleri üzerindeki rolünü keşfetmelerine izin vereceği burada büyük fayda sağlayabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, bu çalışmayı finanse ettikleri ve destekledikleri için EPSRC (EP / L016346 / 1), MRC ve Doktora Eğitim İttifakı Sağlık için Biyobilimler’e teşekkür eder.

Materials

3D Discovery Bioprinter RegenHU BIOFACTORY Microvalve extrusion bioprinter
Agarose  Merck 9012-36-6 Material used to create fluid gel support baths 
Benchtop autoclave Prestige Medical B8L75814 Classic
Brilliant Blue G Merck 6104-58-1 Dye used to stain structures 
Calcium Chloride Dihydrate Merck  10035-04-8 Used to reticulate printed structures 
Dexamethasone Merck  D4902-25MG Used in adipogenic media
DMEM Merck D6429 Cell culture media
Duran  bottle  Merck Z305219 glass bottle 
EVOS XL Core Imaging System EVOS™ AMEX1000 Brightfield microscope with phase contrast
FBS Fisher Scientific 10500-064 Cell culture media supplement
Gellan gum Special Ingredients 5060341112638 Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model
HEPES buffer Merck H9897-10PAK Buffer for cell culture media
Indomethacin Merck I7378 Used in adipogenic media
Isobutyl-methylxanthine (IBMX) Merck I7018-100MG Used in adipogenic media
Keratinocyte growth medium Lonza 00192060 Used as media to culture keratinocytes
Low Methoxy Pectin CP Kelco LM-5CS Pectin used to make pectin/collagen blends
Penicillin-streptomycin Merck P4333-100ML Used to inhibit bacterial growth
PureCol EZ Gel solution Merck 5074 Collagen solution used to make alginate/collagen blends
Sodium Alginate Merck 9005-38-3 Alginate powder used to make alginate/collagen blends 
TrypLE select  Fisher Scientific 12563011 cell dissociation enzyme
T75 Flasks StarLab CC7682-4175 Used for culturing cells
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1880 (2001).
  2. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  3. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  4. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  5. Iordachescu, A., et al. An in vitro model for the development of mature bone containing an osteocyte network. Advanced Biosystems. 2 (2), 1700156 (2018).
  6. Zhang, C., et al. Hydrogel cryopreservation system: an effective method for cell storage. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3330 (2018).
  7. McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
  8. Cheng, W., Zhang, J., Liu, J., Yu, Z. Granular hydrogels for 3D bioprinting applications. View. 1 (3), 20200060 (2020).
  9. Lieben, L. The future of 3D printing of human tissues is taking shape. Nature Reviews Rheumatology. 12 (4), 191 (2016).
  10. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).
  11. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
  12. Zarrintaj, P., et al. Agarose-based biomaterials for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 187, 66-84 (2018).
  13. te Nijenhuis, K. . Thermoreversible Networks: Viscoelastic Properties and Structure of Gels. , 194-202 (1997).
  14. Norton, I. T., Jarvis, D. A., Foster, T. J. A molecular model for the formation and properties of fluid gels. International Journal of Biological Macromolecules. 26 (4), 255-261 (1999).
  15. Fernández Farrés, I., Moakes, R. J. A., Norton, I. T. Designing biopolymer fluid gels: A microstructural approach. Food Hydrocolloids. 42, 362-372 (2014).
  16. Cooke, M. E., et al. Structuring of hydrogels across multiple length scales for biomedical applications. Advanced Materials. 30 (14), 1705013 (2018).
  17. Foster, N. C., Allen, P., El Haj, A. J., Grover, L. M., Moakes, R. J. A. Tailoring therapeutic responses via engineering microenvironments with a novel synthetic fluid gel. Advanced Healthcare Materials. 10 (16), 2100622 (2021).
  18. Ellis, A. L., Norton, A. B., Mills, T. B., Norton, I. T. Stabilisation of foams by agar gel particles. Food Hydrocolloids. 73, 222-228 (2017).
  19. Ghebremedhin, M., Seiffert, S., Vilgis, T. A. Physics of agarose fluid gels: Rheological properties and microstructure. Current Research in Food Science. 4, 436-448 (2021).
  20. Garrec, D. A., Norton, I. T. Understanding fluid gel formation and properties. Journal of Food Engineering. 112 (3), 175-182 (2012).
  21. Garrec, D. A., Guthrie, B., Norton, I. T. Kappa carrageenan fluid gel material properties. Part 1: Rheology. Food Hydrocolloids. 33 (1), 151-159 (2013).
  22. Adams, S., Frith, W. J., Stokes, J. R. Influence of particle modulus on the rheological properties of agar microgel suspensions. Journal of Rheology. 48 (6), 1195-1213 (2004).
  23. Senior, J. J., Cooke, M. E., Grover, L. M., Smith, A. M. Fabrication of complex hydrogel structures using suspended layer additive manufacturing (SLAM). Advanced Functional Materials. 29 (49), 1904845 (2019).
  24. Moakes, R. J. A., et al. A suspended layer additive manufacturing approach to the bioprinting of tri-layered skin equivalents. APL Bioengineering. 5 (4), 046103 (2021).
  25. Moxon, S. R., et al. Suspended manufacture of biological structures. Advanced Materials. 29 (13), 1605594 (2017).
  26. Noor, N., et al. 3D Printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
  27. Compaan, A. M., Song, K., Huang, Y. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (6), 5714-5726 (2019).
  28. Moxon, S. R., et al. Blended alginate/collagen hydrogels promote neurogenesis and neuronal maturation. Materials Science and Engineering: C. 104, 109904 (2019).
  29. Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
  30. Chimene, D., Lennox, K. K., Kaunas, R. R., Gaharwar, A. K. Advanced bioinks for 3D printing: a materials science perspective. Annals of Biomedical Engineering. 44 (6), 2090-2102 (2016).
  31. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  32. Rutz, A. L., Lewis, P. L., Shah, R. N. Toward next-generation bioinks: Tuning material properties pre- and post-printing to optimize cell viability. MRS Bulletin. 42 (8), 563-570 (2017).
  33. Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomedical Materials. 10 (3), 034002 (2015).
  34. Zhou, K., Sun, Y., Yang, J., Mao, H., Gu, Z. Hydrogels for 3D embedded bioprinting: a focused review on bioinks and support baths. Journal of Materials Chemistry B. 10 (12), 1897-1907 (2022).
  35. Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  36. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-Sabah, A., Whitaker, I. S. Printability’ of candidate biomaterials for extrusion based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700264 (2017).
  37. Hinton, T. J., Lee, A., Feinberg, A. W. 3D bioprinting from the micrometer to millimeter length scales: Size does matter. Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 31-37 (2017).
  38. Seoane-Viaño, I., Trenfield, S. J., Basit, A. W., Goyanes, A. Translating 3D printed pharmaceuticals: From hype to real-world clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 553-575 (2021).
  39. Jovic, T. H., Combellack, E. J., Jessop, Z. M., Whitaker, I. S. 3D bioprinting and the future of surgery. Frontiers in Surgery. 7, 609836 (2020).

Tags

Agarose Fluid GelsShear Processing3D BioprintingBioinksSuspending MediumViscometryRheologyOscillatory TestingLinear Viscoelastic Region

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Senior, J. J., Moakes, R. J. A., Cooke, M. E., Moxon, S. R., Smith, A. M., Grover, L. M. Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (195), e64458, doi:10.3791/64458 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image