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Bioengineering

Géis fluidos de agarose formados por processamento de cisalhamento durante gelificação para bioimpressão 3D em suspensão

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/64458
, , , , ,
1Department of Pharmacy,University of Huddersfield, 2School of Chemical Engineering,University of Birmingham, 3Chemical and Biological Engineering,University of Colorado Boulder, 4School of Biological Sciences,University of Manchester

Summary

O processamento de cisalhamento durante a formação de hidrogel resulta na produção de suspensões de microgel que se reestruturam rapidamente, mas rapidamente após a remoção das forças de cisalhamento. Tais materiais têm sido utilizados como matriz de suporte para bioimpressão de estruturas complexas carregadas de células. Aqui, são descritos os métodos utilizados para a fabricação do leito de suporte e das biotintas compatíveis.

Abstract

O uso de matrizes granulares para suportar peças durante o processo de bioimpressão foi relatado pela primeira vez por Bhattacharjee et al., em 2015, e desde então, várias abordagens foram desenvolvidas para a preparação e uso de leitos de gel de suporte em bioimpressão 3D. Este trabalho descreve um processo de fabricação de suspensões de microgel usando agarose (conhecido como gel fluido), em que a formação de partículas é governada pela aplicação de cisalhamento durante a gelificação. Tal processamento produz microestruturas cuidadosamente definidas, com propriedades subsequentes do material que conferem vantagens distintas como a incorporação de meios de impressão, tanto química quanto mecanicamente. Estes incluem comportar-se como materiais sólidos viscoelásticos a cisalhamento zero, limitando a difusão de longo alcance e demonstrando o comportamento característico de afinamento de cisalhamento de sistemas floculados.

Na remoção da tensão de cisalhamento, no entanto, os géis fluidos têm a capacidade de recuperar rapidamente suas propriedades elásticas. Essa ausência de histerese está diretamente ligada às microestruturas definidas anteriormente aludidas; Devido ao processamento, cadeias poliméricas reativas e não gelificadas na interface de partículas facilitam interações interpartículas, semelhante a um efeito Velcro. Essa rápida recuperação das propriedades elásticas permite a bioimpressão de peças de alta resolução a partir de biomateriais de baixa viscosidade, pois a rápida reforma do leito de suporte aprisiona a biotinta in situ, mantendo sua forma. Além disso, uma vantagem dos géis fluidos de agarose são as transições assimétricas de gelificação/fusão (temperatura de gelificação de ~30 °C e temperatura de fusão de ~90 °C). Esta histerese térmica da agarose torna possível imprimir e cultivar a parte bioimpressa in situ sem o fluido de suporte derreter o gel. Este protocolo mostra como fabricar géis fluidos de agarose e demonstra seu uso para apoiar a produção de uma gama de peças complexas de hidrogel dentro da manufatura aditiva de camada suspensa (SLAM).

Introduction

Os hidrogéis são materiais perfeitos para serem utilizados como suportes para o crescimento celular1. Dependendo do material utilizado, gelificam-se por mecanismos suaves que não comprometem a viabilidade celular 2,3. O alto teor de água (tipicamente >90%) significa que os nutrientes e o oxigênio podem facilmente difundir-se para o material e os resíduos do metabolismo celular difundir-separa fora 4. Como tal, a viabilidade celular tem sido preservada por períodos superiores a 1 ano5, e agora há exemplos de hidrogéis sendo usados para armazenar ou “pausar” células para uso terapêutico futuro6. Eles têm sido amplamente utilizados na engenharia de tecidos para a produção de estruturas semelhantes a tecidos, mas seu uso tende a ser limitado pela dificuldade em controlar tanto a estrutura quanto a composição do material. Historicamente, a resistência do hidrogel é comparativamente baixa (em relação a muitos tecidos duros), devido ao alto teor de água e aos baixos volumes ocupados pela matriz polimérica que forma a estrutura. Além disso, muitas rotas para a gelificação (térmica, ionotrópica, fibrilogênese) oferecem cinética razoavelmente lenta, o que significa que suas propriedades mecânicas tendem a se desenvolver de forma constante com o tempo. Com exceção das redes interpenetrantes, a baixa rigidez mecânica e os tempos de cura lentos geralmente resultam em biotintas que são incapazes de se soltar na deposição, tendendo a “cair” e perder a definição quando inicialmente extrudadas.

Na tentativa de superar essa questão-chave, técnicas de impressão embarcadas têm sido desenvolvidas que fornecem suporte durante a impressão, enquanto as propriedades mecânicas do construto estão se desenvolvendo 7,8. Uma vez que a microestrutura do gel tenha se desenvolvido completamente e as propriedades mecânicas atinjam um ponto ótimo, a matriz de suporte pode ser removida, tipicamente através de lavagem suave ou fusão da fase de suporte. Os trabalhos iniciais dessa abordagem utilizaram uma dispersão plurônica viscosa na qual a fase secundária foi distribuída9. Mais recentemente, Bhattacharjee e col. utilizaram géis na forma de carbopol granulado para demonstrar que arranjos de células poderiam ser suspensos no gel de suporte10. Posteriormente, Hinton e col. relataram a extrusão de materiais à base de gel contendo células em um leito de suporte que consistia de uma suspensão de microgel formada a partir de gelatina granular11. Após a extrusão do hidrogel contendo células e sua posterior cura, a gelatina foi removida por aquecimento suave do banho de suporte, permitindo o derretimento da gelatina. Infelizmente, esse processo ainda apresenta várias limitações. Por exemplo, a estrutura química da gelatina em comparação com o colágeno (consequentemente por ser uma forma hidrolisada de colágeno) é tal que muitas metades químicas em sua espinha dorsal podem interagir com entidades biológicas; assim, uma matriz de suporte residual poderia interferir nos processos biológicos a jusante. Além disso, os produtos derivados de animais apresentam uso restritivo quando se olha para a traduzibilidade de uma tecnologia. Isso cria desafios se a peça fabricada se destina a ser usada clinicamente, ou mesmo se deve ser usada para responder a questões biológicas fundamentais, onde essa contaminação da superfície pode causar um problema significativo.

Posteriormente, criamos um processo refinado que permite a fabricação suspensa de hidrogéis, dentro de uma matriz de suporte, que não tem carga em condições fisiológicas e é formada a partir de materiais não animais. Embora o processo possa ser usado com uma gama de suportes biopoliméricos, a agarose fornece um material inerte às interações biológicas, pois é à base de açúcar e carregada de forma neutra em pH fisiológico12,13. Ao invés de fragmentar um gel já existente, o material suporte é formado através da aplicação de cisalhamento durante a gelificação14,15,16. Isso produz uma matriz de partículas que exibem características semelhantes a dendros em sua superfície e são dispersas em uma matriz secundária de polímero não gelificado17,18. O resultado é um material com propriedades materiais interessantes 19,20,21,22 que pode cisalhar-fino de forma semelhante aos géis granulares previamente relatados, mas tende a recuperar a viscosidade mais rapidamente quando o cisalhamento é removido 23. Uma vez que o material portador de células extrudado na matriz de suporte tenha amadurecido completamente, a matriz de suporte pode ser removida através de agitação suave antes de ser colocada em cultura. Tem sido demonstrado que é possível utilizar esse processo para produzir materiais com estruturas complexas e recapitular as estruturas biológicas tanto da pele quanto da região osteocondral23,24,25. Este artigo descreve em detalhes como fabricar o material de suporte e destaca as biotintas apropriadas usadas dentro de uma variedade de estruturas complexas.

Protocol

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes, equipamentos e softwares usados neste protocolo. 1. Preparo do leito de suspensão de gel fluido Preparar 1.000 mL de agarose dispersa (0,5% p/v) adicionando 5 g de agarose em pó a 1.000 mL de água ultrapura (Tipo 1, >18 mΩ·cm-1) em um frasco de vidro de 2.000 mL. Adicione uma barra de agitador magnético de 70 mm à mistura aquosa e prenda a tampa do frasco primeiro apertando totalmente e depois soltando por um quarto de volta. Dissolva e esterilize a mistura colocando o frasco de vidro no cesto da autoclave, fechando a tampa e executando um ciclo por 15 min a 121 °C e 1 Bar.NOTA: Este protocolo é sempre usado para soluções de autoclavagem em etapas posteriores. Retire o frasco da autoclave assim que a autoclave esfriar a 80 °C e coloque-o em um agitador magnético (não aquecido), com o agitador regulado para 800 rpm.CUIDADO: O frasco e o líquido permanecem quentes. Arrefecer o sol em condições ambientes, mantendo a agitação constante, até que a temperatura seja inferior ao seu gel T (ponto gelificante), 32 °C. Retire o frasco do agitador e guarde-o a 4 °C.NOTA: O gel fluido pode ser armazenado até que seja necessário. 2. Preparação de biotintas Preparar uma biotinta à base de gelano usando um sol de 1% (p/p) de goma gelana de baixa acila em água ultrapura (Tipo 1, >18 mΩ·cm-1).Pesar 0,5 g de pó gelano em um barco de pesagem. Adicione 49,5 g de água ultrapura em um frasco de vidro de 100 mL, juntamente com um agitador magnético. Dobre o barco de pesagem contendo energia gelana ao meio e adicione o pó à água lentamente, mexendo constantemente. Dissolver e esterilizar o sol em autoclave e deixar arrefecer até 20 °C. Conservar a biotinta a 4 °C até nova utilização. Preparar uma biotinta misturada de pectina-colágeno em água ultrapura (Tipo 1, >18 mΩ·cm-1).Preparar soluções de pectina a 5% (p/v) de baixa metoximetrina pesando 2,5 g de pó de pectina num barco de pesagem. Adicione 50 mL de água ultrapura em um frasco de vidro de 100 mL, juntamente com um agitador magnético. Dobre o barco de pesagem contendo pectina ao meio e adicione o pó à água lentamente, mexendo constantemente. Autoclave a mistura aquosa e arrefeça até 20 °C. Preparar misturas de pectina-colagénio 1:1 e 2:1 adicionando 3 ml da solução de pectina a 3 ml de solução de colagénio ou adicionando 4 ml da solução de pectina a 2 ml de solução de colagénio, respectivamente. Misture suavemente as misturas usando uma pipeta, retirando e dispensando a mistura 10x.NOTA: Este procedimento é melhor realizado usando materiais frios sobre gelo para evitar a gelificação prematura do colágeno. O pré-resfriamento da pectina e do colágeno pode ser obtido armazenando-se a 4 °C antes da mistura. Conservar a 4 °C até nova utilização. Preparar uma biotinta misturada de alginato e colágeno em água ultrapura (Tipo 1, >18 mΩ·cm-1).Pesar 2 g de pó de alginato em um barco de pesagem. Adicione 50 mL de água ultrapura em um frasco de vidro de 100 mL, juntamente com um agitador magnético. Dobre o barco de pesagem contendo poder de alginato ao meio e adicione o pó à água lentamente, mexendo constantemente. Aquecer a dispersão a 60 °C, sob agitação constante, até que o alginato esteja totalmente dissolvido (líquido límpido, ligeiramente castanho) e, em seguida, arrefecer até 20 °C. Diluir a solução de alginato com meio de cultura celular, como o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM), adicionando 25 mL da solução de alginato a 25 mL de DMEM. Preparar misturas de alginato e colagénio (1:1) adicionando 3 ml da solução de alginato/DMEM a 3 ml de solução de colagénio. Misture suavemente as misturas utilizando uma pipeta, retirando e distribuindo a mistura 10x e conservando a 4 °C.NOTA: Este procedimento é melhor realizado usando materiais frios sobre gelo para evitar a gelificação prematura do colágeno. O pré-resfriamento da pectina e do colágeno pode ser obtido armazenando-se a 4 °C antes da mistura. 3. Caracterização reológica de biotintas Ligue o reômetro, insira geometrias serrilhadas de 40 mm e deixe repousar por 30 min. Zerar a altura do gap do reômetro usando a função zero-gap height. Adicione ~2 mL de amostra na placa inferior e abaixe a geometria superior para criar uma altura de folga de 1 mm. Aparar a amostra removendo o excesso de material expelido entre as placas. Para fazer isso, use uma borda plana e não abrasiva para retirar o excesso de líquido da lacuna e absorva com papel higiênico.Observação : etapas 3.2-3.4 são repetidas para alterar o exemplo antes de cada uma das etapas a seguir. Realizar perfis viscóricos para determinar a injetabilidade da biotinta.Selecione o teste de viscosometria nas opções do usuário . Insira os parâmetros para um ensaio de rampa controlado por taxa de cisalhamento: 0,1 a 500 s-1, com um tempo de rampa de 1 min. Repetir o ensaio de viscometria em rampa em novas amostras sob controlo de tensões, utilizando as tensões superior e inferior determinadas a partir do ensaio em rampa controlada por taxa de cisalhamento do passo 3.5.2. Realizar pequenos testes de deformação para determinar as características de gelificação da biotinta.Selecione o teste oscilatório nas opções do usuário . Parâmetros de entrada em um único teste de frequência sob tensão constante: frequência 1 Hz, deformação 0,5% sobre 1 h, enquanto os géis de tinta. Realizar medições in situ de amplitude e frequência em amostras gelificadas.Selecione teste oscilatório nas opções do usuário . Selecione a varredura de amplitude e insira os parâmetros para um teste de varredura de amplitude que é controlado por deformação: 0,01 a 500%, a uma frequência constante de 1 Hz . Carregue uma nova amostra e selecione o teste oscilatório nas opções do usuário . Em seguida, selecione o teste de frequência, e os parâmetros de frequência de entrada entre 0,01 e 10 Hz e uma deformação que esteja dentro da região viscoelástica linear (LVR) dos espectros determinada a partir dos dados de varredura de amplitude obtidos na etapa 3.7.2 (tipicamente um valor entre 50% e 80% do LVR). 4. Projetando e imprimindo estruturas 3D usando uma bioimpressora 3D Inicie o software CAD para iniciar a geração de um modelo CAD.Selecione Ferramentas | Materiais no software CAD para definir os parâmetros de impressão para a biotinta escolhida. Entrada de parâmetros de impressão relevantes para a impressora que está sendo utilizada; por exemplo, para o 3D Discovery, insira o diâmetro estimado do filamento (~200-500 μm para a maioria das biotintas) na guia de espessura para determinar a espessura Z de cada camada.NOTA: A delaminação da construção final é indicativa da necessidade de aumentar o valor da espessura, enquanto a perda de resolução destaca a necessidade de reduzir a espessura. Projete a estrutura desejada camada por camada usando as guias Layer no software. Agrupe as camadas usando a guia Grupo e atribua cada camada a um nível no plano Z usando a guia Nível .Por exemplo, para gerar uma estrutura de rede (usando uma biotinta misturada de alginato e colágeno preparada na etapa 2.3), crie uma camada com os filamentos ao longo do eixo x e uma segunda camada com os filamentos ao longo do eixo y. Atribua ambos a um Nível separado. Na guia Grupo , determine a altura de construção selecionando o número de unidades repetidas na estrutura. Clique na ferramenta Gerar para criar um código G para o design e exibir uma renderização 3D da estrutura. Feche o BioCAD e inicie o software de interface homem-máquina (IHM) 3D Discovery para iniciar o processo de impressão.Monte o cabeçote de impressão de acordo com as instruções do fabricante. Monte a microválvula no cabeçote de impressão e rosqueie no bocal de extrusão escolhido. Clique na função Medição do comprimento da agulha para calibrar o cabeçote de impressão. Carregue um recipiente de cultura (por exemplo, uma placa de 6 poços) na plataforma de impressão. Aliquote a biotinta no cartucho de impressão e rosqueie na cabeça de impressão acima da microválvula. Conecte o cabeçote de impressão montado ao sistema de pressão pneumática e selecione o cabeçote de impressão na IHM para acoplar. Clique em verificar pressão para permitir o ajuste da pressão de extrusão. Uma vez que uma pressão apropriada tenha sido selecionada (~30-120 kPa, dependendo da resolução desejada), abra o código G gerado anteriormente e clique em Executar para iniciar o processo de impressão. 5. Preparação de análogos da pele Cultura de fibroblastos dérmicos humanos (HDFs) e células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) em DMEM suplementado com soro fetal bovino (FBS) (10%), tampão HEPES (2,5%) e penicilina/estreptomicina (1%) em frascos T75 até atingir 90% de confluência. Cultivar queratinócitos epidérmicos humanos (HEKs) em meios de crescimento de queratinócitos (KGM) até atingir 70%-80% de confluência. Manter todas as células em condições de 37 °C, 5% CO2 e 95% de ar em uma incubadora durante a cultura. Para a preparação de HDFs e ADSCs para biotintas dérmicas e adiposas, lavar as células pipetando suavemente 3 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em frascos, inclinar o frasco para girar o PBS sobre as células e aspirar, tomando cuidado para não perturbar as células ligadas.Para levantar as células, pipetar 3 mL de enzima de dissociação celular 1x para dentro do frasco para cobrir as células e colocar o frasco em uma incubadora por 3 min, batendo firmemente o frasco contra a palma da mão para desalojar as células. Neutralizar a ação da enzima usando 6 mL de DMEM completo.NOTA: Incubar por mais 2 minutos se as células permanecerem ligadas após o toque. Para a preparação das biotintas dérmicas e adiposas, pipetar as suspensões celulares em tubos separados de 15 mL e tomar 10 μL de cada um para contagem celular usando um hemocitômetro. Centrifugar as restantes suspensões celulares a 300 × g durante 5 min para peletizar as células. Aspirar o sobrenadante, com o cuidado de não perturbar o pellet, adicionar a solução de polímero adequada (preparada no passo 2.2) e misturar com estimulação suave por pipetagem nas seguintes densidades:Para a camada adiposa, pipetar 5 × 105 ADSCs mL-1 por mistura de colágeno 1:1 com pectina. Para a camada papilar, pipetar 3 ×10 6 HDFs mL-1 por mistura de colágeno 2:1 com pectina. Para a camada reticular, pipetar 1,5 ×10 6 HDFs mL-1 por mistura de colágeno 2:1 com pectina. Para imprimir, carregue cada biotinta num cartucho separado e imprima a construção no gel fluido de suporte numa placa de Petri de vidro de acordo com as instruções da secção 4.Quando a impressão estiver completa, injete 2 mL de CaCl2∙2H2O 200 mM ao redor da construção e 3 mL de meio adipogênico (DMEM completo suplementado com 500 μM de isobutil-metilxantina [IBMX], 50 μM de indometacina e 1 μM de dexametasona) no gel de fluido usando uma seringa e uma agulha. Coloque em uma incubadora durante a noite. No dia seguinte, retirar a construção do banho de suporte com espátula, lavar suavemente em PBS e cultivar por 14 dias em meio adipogênico em placa de 6 poços. Após 14 dias, remova o meio suficiente para criar uma interface ar-líquido na superfície da construção e semeie 2 ×10 6 queratinócitos no topo da construção para criar uma camada epidérmica. Cultura adicional por 1 semana antes da análise. 6. Preparo do modelo da artéria carótida Coloque a solução de biotinta de goma gelana (conforme preparado na etapa 2.1) em um cartucho de impressora. Imprima o modelo da artéria carótida dentro de uma placa de Petri contendo o material de suporte de gel fluido de acordo com as instruções de impressão na seção 4. Quando a impressão estiver concluída, injete 2 mL de CaCl 200 mM 2∙2H2 O ao redor daconstrução usando uma seringa e agulha. Após um mínimo de 3 h, retire a construção do banho de apoio usando uma espátula e lave suavemente em PBS.

Representative Results

Alginato e biotinta de colágeno tipo IObservou-se que a resolução de impressão (registrada em função do diâmetro do filamento) é diretamente ajustável através de mudanças na pressão de extrusão (Figura 1A-C). A pressão de extrusão e a resolução de impressão foram diretamente relacionadas com os menores diâmetros de filamentos gerados via impressão a uma pressão de extrusão de 30 kPa. Curiosamente, a uma pressão de extrusão de 30 kPa, filamentos que correspondessem ao diâmetro interno do bocal de extrusão poderiam ser gerados (diâmetro médio do filamento: 323 μm ± 50 μm; diâmetro do bocal: 300 μm), sugerindo que uma “resolução máxima” poderia ser alcançada. Além disso, os parâmetros de impressão para essa resolução puderam ser aplicados com sucesso na geração de um tubo vascular de alginato/colágeno que pode ser extraído e perfundido (Figura 1D). Figura 1: Geração de impressões de alta resolução usando SLAM. Personalização da resolução de impressão de redes de alginato/colágeno em função do diâmetro do filamento via extrusão em (A) 30 kPa, (B) 60 kPa e (C) 120 kPa. (D) Geração de um tubo vascular de alginato/colágeno. Barras de escala = 400 μm (A-C), 10 mm (D). Abreviação: SLAM = manufatura aditiva de camada suspensa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Análogos da peleSLAM também foi usado para criar uma estrutura semelhante à pele (Figura 2A) usando uma biotinta formada a partir de uma mistura de colágeno I e pectina. Para obter um gradiente de propriedades mecânicas semelhante àquelas encontradas na pele, diferentes proporções de pectina e colágeno foram usadas nas camadas dérmica (pectina 5% p/p misturada a 2:1 com um estoque de colágeno de 5 mg∙mL−1) e hipodérmica (5% p/p de pectina misturada a 1:1 com um estoque de colágeno de 5 mg∙mL−1). A estrutura resultante (Figura 2Bi-Bii) estava bem integrada após imersão em DMEM, sem sinais de delaminação. É importante ressaltar que houve um alto nível de viabilidade celular em toda a estrutura (Figura 2Biii) após um período de 14 dias de cultivo. Curiosamente, ao longo do período de cultura, os materiais endureceram24, indicando uma remodelação do material. Figura 2: Produção de uma estrutura semelhante à pele. (A) Um esquema mostrando como o processo SLAM foi usado para produzir uma estrutura em camadas embutida com fibroblastos dérmicos humanos. O leito de suspensão foi confeccionado a partir de partículas formadas a partir de agarose, enquanto as camadas hipodérmica e dérmica foram formadas de proporções variáveis de pectina e colágeno I. (B) A estrutura em camadas foi concebida para representar a estrutura tricamadas da pele (i). Com o sucesso em replicar essa estrutura (ii), altos níveis de viabilidade celular foram observados ao longo das amostras, como demonstrado pela coloração de calceína-AM (iii). Barra de escala = 5 mm (Bii). Abreviação: SLAM = manufatura aditiva de camada suspensa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Artéria carótidaPara ultrapassar os limites do método, uma seleção de estampas mais complexas foi produzida. Em um desses exemplos, uma artéria carótida bifurcada foi impressa com biotinta gelana a 1% (Figura 3A), que foi então reticulada por extrusão de CaCl2 200 mM dentro do leito de gel fluido (Figura 3B) e simplesmente levantada do suporte após a gelificação (Figura 3C). Apesar das soluções de impressão precursora exibirem baixa viscosidade, o leito de suporte foi bem-sucedido em permitir a produção da geometria complexa. A artéria manteve sua estrutura durante a deposição, reticulação e extração (Figura 3), sem a necessidade de modificar os códigos de impressão para incorporar andaimes adicionais. Figura 3: Processo de fabricação da artéria carótida gelana utilizando SLAM. (A) Extrusão de gelano dentro do leito de gel fluido durante a impressão, (B) impressão completa da artéria carótida dentro do gel de fluido durante a reticulação e (C) modelo final da artéria carótida após recuperação do suporte de gel fluido. Barras de escala = 10 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Consideração da seleção dos materiais utilizados para o leito de apoio
Durante a fase de desenvolvimento, foram várias as características exigidas do leito de apoio. Essas características incluíram: i) manter estrutura suficiente para suspender o material extrusado; ii) capacidade de desbaste de cisalhamento para permitir que a cabeça de impressão se mova livremente através do material de suporte; iii) rápida reestruturação (propriedades auto-cicatrizantes), formando suporte ao redor da biotinta depositada; iv) termicamente estável à temperatura ambiente e fisiológica; v) material neutro (isto é, sem carga), relativamente bioinerte, em uma faixa de pH e eletrólitos (espécies e concentrações iônicas), impedindo interações com células e biotintas carregadas; vi) atóxico; e, vii) preferencialmente de origem não animal.

Embora existam muitos materiais biopoliméricos que mantêm várias dessas características inerentes, com capacidade de realizar a fabricação de aditivos 3D em suspensão sem se adequar a todas essas características 11,26,27, a intenção aqui foi produzir um leito de suporte que superasse certas questões práticas associadas a outros materiais de suporte. Devido às propriedades químicas da agarose e, em particular, quando formulada como um gel fluido particulado, todas essas características puderam ser obtidas. Isso possibilitou um leito de suporte que poderia ser utilizado em uma grande variedade de biotintas23,24,25,28. De fato, a natureza bioinerte do material forneceu o potencial de manter a estrutura impressa in situ durante toda a cultura, permitindo escalas de tempo suficientes para que muitas biotintas diferentes se desenvolvessem completamente, sem alterações na biologia. Além disso, a natureza particulada e desbastada permitiu a facilidade de remoção do construto final impresso, enquanto a origem não tóxica e não animal permitiu o potencial de rápida tradução para a clínica, superando barreiras relacionadas às exigências éticas e regulatórias.

Considerações na seleção de materiais para as biotintas
Na bioimpressão por extrusão direta, as biotintas são depositadas em uma cama de impressão 2D. É benéfico que as soluções de biotinta de monômero tenham comportamento de cisalhamento; no entanto, para produzir construções de alta fidelidade com dimensões fisiologicamente relevantes, elas devem ter baixa tixotropia e se recuperar para viscosidades suficientemente altas para que formem filamentos sólidos após a deposição 29,30,31. Com o aumento da viscosidade, a pressão necessária para a extrusão é muito maior, muitas vezes influenciando negativamente a viabilidade da célula encapsulada31,32. A bioimpressão em suspensão elimina essa limitação, pois o material extrudado é suportado pelo banho de suspensão durante toda a reticulação. Este desenvolvimento aumenta enormemente a gama de formulações de biotinta que podem ser usadas. Por exemplo, trabalhos recentes mostraram o uso de soluções de colágeno de baixa concentração sendo impressas em geometrias altamente complexas análogas à estrutura interna do coração33,34,35. Nas aplicações mencionadas nesse método, a impressão embarcada permitiu que as tintas de biomateriais fossem escolhidas para melhor replicar o ambiente fisiológico a que se destinavam, em vez de sua capacidade de impressão.

Limitações no tamanho da estrutura
Ao longo da literatura de biofabricação, tem sido demonstrado que diferentes tipos de bioimpressoras, impulsionadas por tecnologias alternativas de cabeças de impressão, podem ser incorporadas em técnicas de fabricação embarcadas. A tecnologia aqui demonstrada não é diferente, com exemplos que incluem uma bioimpressora pneumática baseada em microextrusão (INKREDIBLE), como demonstrado por Senior et al., e bioimpressoras baseadas em extrusão com microválvulas controláveis (3D Discovery)23. Embora isso torne a tecnologia acessível a uma gama de usuários que já podem possuir uma bioimpressora, as limitações no tamanho atingível da estrutura dependem, em última análise, das especificações da bioimpressora em questão. Inicialmente, a principal restrição à geração de grandes estruturas é definida pelo tamanho do leito de impressão, os limites das trajetórias X, Y e Z, e também o tamanho do vaso no qual o gel fluido de suporte está contido.

Limitações na resolução
Ao fabricar estruturas intrincadas de tamanho micrométrico, a resolução resultante é altamente dependente da precisão da impressora (controle sobre o tamanho do passo, grau de extrusão), do diâmetro interno do bocal de impressão e de uma variedade de parâmetros de software ajustáveis, incluindo velocidade de impressão, pressão de impressão e velocidade de fluxo36. Além disso, o controle do tamanho das gotículas parece ser fundamental para facilitar a geração de estruturas de alta resolução, com os melhores resultados observados em impressoras de extrusão com microválvula controlável. Em última análise, quando todos os parâmetros são otimizados, as resoluções de impressão podem ser alcançadas para igualar, ou até mesmo ser menor que, o diâmetro interno dos bicos de extrusão, com o filamento depositado na ordem da escala micrométrica37. No entanto, isso depende da otimização de todos os parâmetros de impressão mencionados anteriormente, e a resolução pode ser consideravelmente limitada pelo mecanismo de impressão e precisão. A extrusão pneumática, por exemplo, não parece permitir a mesma resolução de impressão que a extrusão com uma microválvula controlável. Há, portanto, uma implicação de custo potencial para alcançar a resolução máxima de impressão, uma vez que tais sistemas incorrem em um custo significativamente maior para o usuário.

Perspectivas futuras e potencial
No momento, há muito interesse em torno do uso de processos de fabricação em suspensão para permitir a produção de estruturas moles complexas contendo células embutidas, e sem dúvida haverá avanços significativos nos próximos anos. Avanços contínuos na melhoria da resolução de impressão são dados, embora ainda não se saiba o quão necessário isso será, dado que a maioria dos sistemas biológicos é capaz de se reorganizar em nível molecular. Enquanto o foco de interesse na mídia está em torno do uso de tecidos impressos em 3D para substituir diretamente tecidos humanos após lesões ou doenças, quaisquer procedimentos médicos robustos possibilitados por esses processos estão a alguns anos de distância38,39. É mais provável que o impacto desses complexos sistemas de cultura esteja na triagem de fármacos ou mesmo utilizados como ferramentas, para melhorar nossa compreensão dos processos biológicos38. Em particular, a biologia do desenvolvimento poderia se beneficiar muito aqui, onde o controle preciso sobre a deposição especial de moléculas permitirá que os pesquisadores explorem o papel de sistemas multifatoriais em processos de desenvolvimento tecidual.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer ao EPSRC (EP/L016346/1), MRC e à Doctoral Training Alliance Biosciences for Health pelo financiamento e apoio a este trabalho.

Materials

3D Discovery Bioprinter RegenHU BIOFACTORY Microvalve extrusion bioprinter
Agarose  Merck 9012-36-6 Material used to create fluid gel support baths 
Benchtop autoclave Prestige Medical B8L75814 Classic
Brilliant Blue G Merck 6104-58-1 Dye used to stain structures 
Calcium Chloride Dihydrate Merck  10035-04-8 Used to reticulate printed structures 
Dexamethasone Merck  D4902-25MG Used in adipogenic media
DMEM Merck D6429 Cell culture media
Duran  bottle  Merck Z305219 glass bottle 
EVOS XL Core Imaging System EVOS™ AMEX1000 Brightfield microscope with phase contrast
FBS Fisher Scientific 10500-064 Cell culture media supplement
Gellan gum Special Ingredients 5060341112638 Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model
HEPES buffer Merck H9897-10PAK Buffer for cell culture media
Indomethacin Merck I7378 Used in adipogenic media
Isobutyl-methylxanthine (IBMX) Merck I7018-100MG Used in adipogenic media
Keratinocyte growth medium Lonza 00192060 Used as media to culture keratinocytes
Low Methoxy Pectin CP Kelco LM-5CS Pectin used to make pectin/collagen blends
Penicillin-streptomycin Merck P4333-100ML Used to inhibit bacterial growth
PureCol EZ Gel solution Merck 5074 Collagen solution used to make alginate/collagen blends
Sodium Alginate Merck 9005-38-3 Alginate powder used to make alginate/collagen blends 
TrypLE select  Fisher Scientific 12563011 cell dissociation enzyme
T75 Flasks StarLab CC7682-4175 Used for culturing cells
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References

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Senior, J. J., Moakes, R. J. A., Cooke, M. E., Moxon, S. R., Smith, A. M., Grover, L. M. Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (195), e64458, doi:10.3791/64458 (2023).
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