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Bioengineering

Gels fluides d’agarose formés par traitement de cisaillement pendant la gélification pour la bio-impression 3D en suspension

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/64458
, , , , ,
1Department of Pharmacy,University of Huddersfield, 2School of Chemical Engineering,University of Birmingham, 3Chemical and Biological Engineering,University of Colorado Boulder, 4School of Biological Sciences,University of Manchester

Summary

Le traitement par cisaillement pendant la formation d’hydrogel entraîne la production de suspensions de microgel qui cisaillent mais se restructurent rapidement après l’élimination des forces de cisaillement. Ces matériaux ont été utilisés comme matrice de support pour la bio-impression de structures complexes chargées de cellules. Ici, les méthodes utilisées pour fabriquer le lit de support et les bio-encres compatibles sont décrites.

Abstract

L’utilisation de matrices granulaires pour soutenir les pièces pendant le processus de bio-impression a été signalée pour la première fois par Bhattacharjee et al. en 2015, et depuis lors, plusieurs approches ont été développées pour la préparation et l’utilisation de lits de gel de support dans la bio-impression 3D. Cet article décrit un procédé de fabrication de suspensions de microgel à l’aide d’agarose (connu sous le nom de gels fluides), dans lequel la formation de particules est régie par l’application de cisaillement pendant la gélification. Un tel traitement produit des microstructures soigneusement définies, avec des propriétés matérielles ultérieures qui confèrent des avantages distincts en tant que supports d’impression, à la fois chimiquement et mécaniquement. Il s’agit notamment de se comporter comme des matériaux viscoélastiques semblables à des solides à cisaillement nul, de limiter la diffusion à longue distance et de démontrer le comportement caractéristique d’amincissement par cisaillement des systèmes floculés.

Cependant, lors de l’élimination de la contrainte de cisaillement, les gels fluides ont la capacité de récupérer rapidement leurs propriétés élastiques. Cette absence d’hystérésis est directement liée aux microstructures définies précédemment évoquées ; En raison du traitement, les chaînes polymères réactives et non gélifiées à l’interface des particules facilitent les interactions interparticulaires, similaires à un effet Velcro. Cette récupération rapide des propriétés élastiques permet de bioimprimer des pièces haute résolution à partir de biomatériaux à faible viscosité, car la reformation rapide du lit de support piège la bio-encre in situ, en maintenant sa forme. De plus, un avantage des gels fluides d’agarose est les transitions gélifiant/fusion asymétriques (température de gélification de ~30 °C et température de fusion de ~90 °C). Cette hystérésis thermique de l’agarose permet d’imprimer et de cultiver la partie bio-imprimée in situ sans que le gel fluide de support ne fonde. Ce protocole montre comment fabriquer des gels fluides d’agarose et démontre leur utilisation pour soutenir la production d’une gamme de pièces complexes d’hydrogel dans la fabrication additive en couche suspendue (SLAM).

Introduction

Les hydrogels sont des matériaux parfaits à utiliser comme supports pour la croissance cellulaire1. Selon le matériau utilisé, ils se gélient via des mécanismes doux qui ne compromettent pas la viabilité cellulaire 2,3. La teneur élevée en eau (généralement >90%) signifie que les nutriments et l’oxygène peuvent facilement diffuser dans les matières et les déchets du métabolisme cellulaire diffusent4. En tant que tel, il a été démontré que la viabilité cellulaire est préservée pendant des périodes supérieures à 1 an5, et il existe maintenant des exemples d’hydrogels utilisés pour stocker ou « mettre en pause » des cellules pour une utilisation thérapeutique future6. Ils ont été largement utilisés en ingénierie tissulaire pour la production de structures tissulaires, mais leur utilisation tend à être limitée par la difficulté de contrôler à la fois la structure et la composition du matériau. Historiquement, la résistance de l’hydrogel est comparativement faible (par rapport à de nombreux tissus durs), en raison de la teneur élevée en eau et des faibles volumes occupés par la matrice polymère formant la structure. De plus, de nombreuses voies de gélification (thermique, ionotropique, fibrillogenèse) offrent une cinétique raisonnablement lente, ce qui signifie que leurs propriétés mécaniques ont tendance à se développer régulièrement avec le temps. À l’exception des réseaux interpénétrants, la faible rigidité mécanique et les temps de durcissement lents entraînent souvent des bio-encres incapables de résister librement au dépôt, ce qui tend à « s’affaisser » et à perdre sa définition lorsqu’elles sont initialement extrudées.

Pour tenter de surmonter ce problème clé, des techniques d’impression embarquées ont été développées qui fournissent un support pendant l’impression, tandis que les propriétés mécaniques de la construction se développent 7,8. Une fois que la microstructure du gel s’est complètement développée et que les propriétés mécaniques ont atteint un optimum, la matrice de support peut être éliminée, généralement par lavage doux ou fusion de la phase de support. Les travaux initiaux sur cette approche ont utilisé une dispersion pluronique visqueuse dans laquelle la phase secondaire a été distribuée9. Plus récemment, Bhattacharjee et al. ont utilisé des gels sous forme de carbopol granulé pour démontrer que des réseaux de cellules pouvaient être suspendus dans le gel de support10. Par la suite, Hinton et coll. ont fait état de l’extrusion de matériaux à base de gel contenant des cellules dans un lit de support constitué d’une suspension de microgel formée de gélatinegranulaire 11. Après extrusion de l’hydrogel contenant des cellules et son durcissement ultérieur, la gélatine a été éliminée par chauffage doux du bain de support, permettant la fusion de la gélatine. Malheureusement, ce processus présente encore plusieurs limites. Par exemple, la structure chimique de la gélatine par rapport au collagène (par conséquent étant une forme hydrolysée de collagène) est telle que de nombreuses fractions chimiques à travers son épine dorsale peuvent interagir avec des entités biologiques; Ainsi, une matrice de support résiduelle pourrait interférer avec les processus biologiques en aval. De plus, les produits d’origine animale posent une utilisation restrictive lorsqu’on cherche à traduire une technologie. Cela crée des défis si la pièce fabriquée est destinée à être utilisée cliniquement, ou même si elle doit être utilisée pour répondre à des questions biologiques fondamentales, où cette contamination de surface peut causer un problème important.

Nous avons par la suite créé un procédé raffiné qui permet la fabrication en suspension d’hydrogels, dans une matrice de support, qui n’a pas de charge dans des conditions physiologiques et qui est formée à partir de matériaux non animaux. Bien que le procédé puisse être utilisé avec une gamme de supports biopolymères, l’agarose fournit un matériau inerte aux interactions biologiques car il est à base de sucre et chargé de manière neutre à pH physiologique12,13. Plutôt que de fragmenter un gel déjà existant, le matériau de support est formé par l’application de cisaillement pendant la gélification14,15,16. Cela produit une matrice de particules qui présentent des caractéristiques de type dendron à leur surface et sont dispersées dans une matrice secondaire de polymère non gélifié17,18. Le résultat est un matériau avec des propriétés matérielles intéressantes 19,20,21,22 qui peut cisailler de la même manière que les gels granulaires précédemment rapportés, mais qui a tendance à récupérer sa viscosité plus rapidement lorsque le cisaillement est éliminé 23. Une fois que le matériau porteur de cellules extrudé dans la matrice de support a complètement mûri, la matrice de support peut être retirée par agitation douce avant d’être mise en culture. Il a été démontré qu’il est possible d’utiliser ce procédé pour produire des matériaux aux structures complexes et récapituler les structures biologiques de la peau et de la région ostéochondrale23,24,25. Ce document sur les méthodes décrit en détail comment fabriquer le matériau de support et met en évidence les bio-encres appropriées utilisées dans une variété de structures complexes.

Protocol

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole. 1. Préparation du lit de suspension de gel fluide Préparer 1 000 mL d’agarose dispersée (0,5 % p/v) en ajoutant 5 g de poudre d’agarose à 1 000 mL d’eau ultrapure (type 1, >18 mΩ·cm-1) dans une bouteille en verre de 2 000 mL. Ajouter une barre magnétique d’agitation de 70 mm au mélange aqueux et fixer le bouchon du flacon en serrant d’abord complètement, puis en desserrant d’un quart de tour. Dissoudre et stériliser le mélange en plaçant le flacon en verre dans le panier de l’autoclave, en fermant le couvercle et en faisant fonctionner un cycle de 15 min à 121 °C et 1 bar.REMARQUE: Ce protocole est toujours utilisé pour les solutions d’autoclavage dans les étapes suivantes. Retirez la bouteille de l’autoclave une fois que l’autoclave a refroidi à 80 °C et placez-la sur un agitateur magnétique (non chauffé), l’agitation étant réglée à 800 tr/min.ATTENTION : Le flacon et le liquide restent chauds. Refroidir le sol dans des conditions ambiantes, tout en maintenant une agitation constante, jusqu’à ce que la température soit inférieure à son gel T (point gélifiant), 32 °C. Retirez le flacon de l’agitateur et conservez-le à 4 °C.REMARQUE: Le gel fluide peut être conservé jusqu’à ce que vous en ayez besoin. 2. Préparation des bio-encres Préparer une bio-encre à base de gellan en utilisant un sol à 1% (p/p) de gomme gellane à faible teneur en acyle dans de l’eau ultrapure (Type 1, >18 mΩ·cm-1).Peser 0,5 g de poudre de gellane dans un bateau de pesée. Ajouter 49,5 g d’eau ultrapure dans une bouteille en verre de 100 mL, avec un agitateur magnétique. Pliez le bateau de pesée contenant la puissance gellane en deux et ajoutez la poudre à l’eau lentement, tout en remuant constamment. Dissoudre et stériliser le sol à l’aide d’un autoclave et laisser refroidir à 20 °C. Conserver la bio-encre à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation. Préparez une bio-encre mélangée à la pectine et au collagène dans de l’eau ultrapure (Type 1, >18 mΩ·cm-1).Préparer des solutions de pectine à 5 % (p/v) à faible teneur en méthoxy en pesant 2,5 g de poudre de pectine dans un bateau de pesée. Ajouter 50 ml d’eau ultrapure dans une bouteille en verre de 100 ml, avec un agitateur magnétique. Pliez le bateau de pesée contenant de la pectine en deux et ajoutez la poudre à l’eau lentement, tout en remuant constamment. Autoclaver le mélange aqueux et refroidir à 20 °C. Préparer des mélanges de pectine et de collagène 1:1 et 2:1 en ajoutant 3 mL de la solution de pectine à 3 mL de solution de collagène ou en ajoutant 4 mL de la solution de pectine à 2 mL de solution de collagène, respectivement. Mélanger délicatement les mélanges à l’aide d’une pipette, en retirant et en distribuant le mélange 10x.REMARQUE: Cette procédure est mieux entreprise en utilisant des matériaux froids sur la glace pour prévenir la gélification prématurée du collagène. Le prérefroidissement de la pectine et du collagène peut être réalisé en stockant à 4 °C avant le mélange. Conserver à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation. Préparer une bio-encre mélangée alginate-collagène dans de l’eau ultrapure (Type 1, >18 mΩ·cm-1).Peser 2 g de poudre d’alginate dans un bateau de pesée. Ajouter 50 ml d’eau ultrapure dans une bouteille en verre de 100 ml, avec un agitateur magnétique. Pliez le bateau de pesée contenant de l’alginate en deux et ajoutez la poudre à l’eau lentement, tout en remuant constamment. Chauffer la dispersion à 60 °C, sous agitation constante, jusqu’à ce que l’alginate soit complètement dissous (liquide clair et légèrement brun), puis refroidir à 20 °C. Diluer la solution d’alginate avec un milieu de culture cellulaire tel que le milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco en ajoutant 25 mL de la solution d’alginate à 25 mL de DMEM. Préparer des mélanges alginate-collagène (1:1) en ajoutant 3 mL de la solution d’alginate/DMEM à 3 mL de solution de collagène. Mélanger délicatement les mélanges à l’aide d’une pipette en retirant et en distribuant le mélange 10x et en conservant à 4 °C.REMARQUE: Cette procédure est mieux entreprise en utilisant des matériaux froids sur la glace pour prévenir la gélification prématurée du collagène. Le prérefroidissement de la pectine et du collagène peut être réalisé en stockant à 4 °C avant le mélange. 3. Caractérisation rhéologique des bio-encres Allumez le rhéomètre, insérez des géométries dentelées de 40 mm et laissez reposer pendant 30 min. Mettez à zéro la hauteur d’écart du rhéomètre à l’aide de la fonction de hauteur d’espace zéro. Ajouter ~2 mL d’échantillon sur la plaque inférieure et abaisser la géométrie supérieure pour créer une hauteur d’écart de 1 mm. Couper l’échantillon en enlevant l’excès de matière expulsé entre les plaques. Pour ce faire, utilisez un bord plat et non abrasif pour retirer l’excès de liquide de l’espace et imprégnez-le de papier de soie.REMARQUE : Les étapes 3.2 à 3.4 sont répétées pour modifier l’échantillon avant chacune des étapes suivantes. Entreprendre des profils de viscométrie pour déterminer l’injectabilité de la bio-encre.Sélectionnez test de viscométrie dans les options utilisateur . Entrez les paramètres pour un essai de rampe contrôlée par vitesse de cisaillement : 0,1 à 500 s-1, avec un temps de rampe de 1 min. Répéter l’essai de viscométrie sur rampe sur de nouveaux échantillons sous contrôle des contraintes, en utilisant les contraintes supérieures et inférieures déterminées à partir de l’essai de rampe à vitesse de cisaillement contrôlée à l’étape 3.5.2. Effectuer de petits tests de déformation pour déterminer les caractéristiques gélifiantes de la bio-encre.Sélectionnez Test oscillatoire dans les options utilisateur . Paramètres d’entrée dans un seul test de fréquence sous déformation constante: fréquence 1 Hz, déformation 0,5% sur 1 h, tandis que l’encre gélifie. Effectuer des mesures d’amplitude et de fréquence in situ sur des échantillons gélifiés.Sélectionnez Test oscillatoire dans les options utilisateur . Sélectionnez le balayage d’amplitude et entrez les paramètres pour un test de balayage d’amplitude contrôlé : 0,01 à 500 %, à une fréquence constante de 1 Hz . Chargez un nouvel échantillon et sélectionnez Test oscillatoire dans les options utilisateur . Ensuite, sélectionnez l’essai de fréquence et les paramètres de fréquence d’entrée compris entre 0,01 et 10 Hz et une déformation qui se trouve dans la région viscoélastique linéaire (LVR) des spectres déterminés à partir des données de balayage d’amplitude obtenues à l’étape 3.7.2 (généralement une valeur comprise entre 50 % et 80 % du LVR). 4. Conception et impression de structures 3D à l’aide d’une bio-imprimante 3D Lancez un logiciel de CAO pour démarrer la génération d’un modèle CAO.Sélectionnez Outils | Matériaux dans le logiciel de CAO pour définir les paramètres d’impression de la bio-encre choisie. Entrez les paramètres d’impression pertinents pour l’imprimante utilisée; par exemple, pour la découverte 3D, entrez le diamètre de filament estimé (~200-500 μm pour la plupart des bio-encres) dans l’onglet d’épaisseur pour déterminer l’épaisseur Z de chaque couche.REMARQUE: Le délaminage de la construction finale indique la nécessité d’augmenter la valeur de l’épaisseur, tandis que la perte de résolution souligne la nécessité de réduire l’épaisseur. Concevez la structure souhaitée couche par couche à l’aide des onglets Calque du logiciel. Regroupez les calques à l’aide de l’onglet Groupe et affectez chaque calque à un niveau du plan Z à l’aide de l’onglet Niveau .Par exemple, pour générer une structure en treillis (à l’aide d’une bio-encre mélangée alginate-collagène préparée à l’étape 2.3), créez une couche avec les filaments le long de l’axe x et une deuxième couche avec les filaments le long de l’axe y. Affectez les deux à un niveau distinct. Sous l’onglet Groupe , déterminez la hauteur de construction en sélectionnant le nombre d’unités répétées dans la structure. Cliquez sur l’outil Générer pour créer un code G pour la conception et afficher un rendu 3D de la structure. Fermez BioCAD et lancez le logiciel d’interface homme-machine (IHM) 3D Discovery pour lancer le processus d’impression.Assemblez la tête d’impression conformément aux instructions du fabricant. Montez la microvalve sur la tête d’impression et vissez la buse d’extrusion choisie. Cliquez sur la fonction Mesure de la longueur de l’aiguille pour calibrer la tête d’impression. Chargez un récipient de culture (p. ex., une plaque à 6 puits) sur la plate-forme d’impression. Aliquote la bio-encre dans la cartouche d’impression et vissez dans la tête d’impression au-dessus de la micro-vanne. Connectez la tête d’impression assemblée au système de pression pneumatique et sélectionnez la tête d’impression sur l’IHM pour l’enclencher. Cliquez sur vérifier la pression pour permettre le réglage de la pression d’extrusion. Une fois qu’une pression appropriée a été sélectionnée (~30-120 kPa en fonction de la résolution souhaitée), ouvrez le G-code généré précédemment et cliquez sur Exécuter pour lancer le processus d’impression. 5. Préparation d’analogues cutanés Culture de fibroblastes dermiques humains (HDF) et de cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC) dans le DMEM complétés par du sérum bovin fœtal (FBS) (10%), un tampon HEPES (2,5%) et de la pénicilline/streptomycine (1%) dans des flacons T75 jusqu’à ce que la confluence soit atteinte à 90%. Culture de kératinocytes épidermiques humains (HEK) dans des milieux de croissance kératinocytaires (KGM) jusqu’à ce que la confluence de 70% à 80% soit atteinte. Conservez toutes les cellules dans des conditions de 37 °C, 5% de CO2 et 95% d’air dans un incubateur pendant la culture. Pour la préparation des HDF et des ADSC pour les bioencres cutanées et adipeuses, laver les cellules en pipetant doucement 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans des flacons, incliner la fiole pour faire tourbillonner le PBS sur les cellules et aspirer en prenant soin de ne pas déranger les cellules attachées.Pour soulever les cellules, pipeter 3 mL de 1x enzyme de dissociation cellulaire dans le flacon pour couvrir les cellules et placer le ballon dans un incubateur pendant 3 min, en tapotant fermement le flacon contre la paume de la main pour déloger les cellules. Neutraliser l’action de l’enzyme en utilisant 6 mL de DMEM complet.REMARQUE: Incuber pendant 2 minutes supplémentaires si les cellules restent attachées après le tapotement. Pour la préparation des bioencres dermiques et adipeuses, pipeter les suspensions cellulaires dans des tubes séparés de 15 ml et prélever 10 μL de chacun pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifuger les suspensions cellulaires restantes à 300 × g pendant 5 min pour granuler les cellules. Aspirer le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber la pastille, ajouter la solution polymère appropriée (préparée à l’étape 2.2), et mélanger par stimulation douce par pipetage aux densités suivantes :Pour la couche adipeuse, pipeter 5 × 105 ADSC mL-1 par mélange collagène/pectine 1:1. Pour la couche papillaire, pipeter 3 × 106 HDF mL-1 par mélange collagène/pectine 2:1. Pour la couche réticulaire, pipeter 1,5 × 106 HDF mL-1 par mélange collagène-pectine 2:1 . Pour imprimer, chargez chaque bio-encre dans une cartouche séparée et imprimez la construction dans le gel fluide de support dans une boîte de Petri en verre conformément aux instructions de la section 4.Une fois l’impression terminée, injecter 2 mL de 200 mM de CaCl 2∙2H2O autour de la construction et 3 mL de milieu adipogène (DMEM complet complété par 500 μM d’isobutyl-méthylxanthine [IBMX], 50 μM d’indométacine et 1 μM de dexaméthasone) dans le gel fluide à l’aide d’une seringue et d’une aiguille. Placer dans un incubateur pendant la nuit. Le lendemain, retirer la construction du bain de support à l’aide d’une spatule, laver doucement dans du PBS et cultiver pendant 14 jours en milieu adipogène dans une plaque à 6 puits. Après 14 jours, prélever suffisamment de milieu pour créer une interface air-liquide à la surface de la construction et ensemencer 2 × 106 kératinocytes au sommet de la construction pour créer une couche épidermique. Culture plus loin pendant 1 semaine avant l’analyse. 6. Préparation du modèle d’artère carotide Chargez la solution de gomme gellane bioink (préparée à l’étape 2.1) dans une cartouche d’imprimante. Imprimez le modèle d’artère carotide dans une boîte de Petri contenant le matériau de support du gel fluide conformément aux instructions d’impression de la section 4. Une fois l’impression terminée, injecter 2 mL de 200 mM de CaCl 2∙2H2O autour de la construction à l’aide d’une seringue et d’une aiguille. Après un minimum de 3 h, retirer la construction du bain de support à l’aide d’une spatule et laver doucement au PBS.

Representative Results

Alginate et bio-encre de collagène de type IOn a observé que la résolution d’impression (enregistrée en fonction du diamètre du filament) était directement réglable par les changements de pression d’extrusion (figure 1A-C). La pression d’extrusion et la résolution d’impression étaient directement liées aux plus petits diamètres de filament générés par impression à une pression d’extrusion de 30 kPa. Il est intéressant de noter qu’à une pression d’extrusion de 30 kPa, des filaments correspondant au diamètre intérieur de la buse d’extrusion pouvaient être générés (diamètre moyen du filament: 323 μm ± 50 μm; diamètre de la buse: 300 μm), suggérant qu’une « résolution maximale » pourrait être atteinte. De plus, les paramètres d’impression pour cette résolution pourraient être appliqués avec succès à la génération d’un tube vasculaire alginate/collagène qui peut être extrait et perfusé (Figure 1D). Figure 1 : Génération d’impressions haute résolution à l’aide de SLAM. Adaptation de la résolution d’impression des réseaux d’alginate/collagène en fonction du diamètre du filament par extrusion à (A) 30 kPa, (B) 60 kPa et (C) 120 kPa. (D) Génération d’un tube vasculaire alginate/collagène. Barres d’échelle = 400 μm (A-C), 10 mm (D). Abréviation : SLAM = fabrication additive à couche suspendue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Analogues cutanésLe SLAM a également été utilisé pour créer une structure semblable à la peau (Figure 2A) à l’aide d’une bio-encre formée à partir d’un mélange de collagène I et de pectine. Pour obtenir un gradient de propriétés mécaniques similaires à celles trouvées dans la peau, différentes proportions de pectine et de collagène ont été utilisées dans les couches dermiques (5% p/p de pectine mélangée à 2:1 avec un stock de collagène de 5 mg∙mL −1) et hypodermiques (5% p/p de pectine mélangée à 1:1 avec un stock de collagène de 5 mg∙mL−1 ). La structure résultante (Figure 2Bi-Bii) a été bien intégrée après immersion dans DMEM, sans signe de délamination. Fait important, il y avait un niveau élevé de viabilité cellulaire dans toute la structure (figure 2Biii) après une période de culture de 14 jours. Fait intéressant, au cours de la période de culture, les matériaux se sont raidis24, indiquant un remodelage du matériau. Figure 2 : Production d’une structure semblable à celle de la peau. (A) Un schéma montrant comment le processus SLAM a été utilisé pour produire une structure en couches intégrée à des fibroblastes dermiques humains. Le lit suspendu ici a été fabriqué à partir de particules formées d’agarose, tandis que les couches hypodermiques et dermiques ont été formées de proportions variables de pectine et de collagène I. (B) La structure en couches était destinée à représenter la structure tricouche de la peau (i). Avec le succès de la réplication de cette structure (ii), des niveaux élevés de viabilité cellulaire ont été notés dans tous les échantillons, comme le montre la coloration calcéine-AM (iii). Barre d’échelle = 5 mm (Bii). Abréviation : SLAM = fabrication additive à couche suspendue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. CarotidePour repousser les limites de la méthode, une sélection de tirages plus complexes a été produite. Dans l’un de ces exemples, une artère carotide bifurquée a été imprimée à l’aide de bioencre gélanane à 1 % (figure 3A), qui a ensuite été réticulée par extrusion de 200 mM de CaCl2 dans le lit de gel fluide (figure 3B) et simplement soulevée du support après gélification (figure 3C). Malgré les solutions d’impression précurseur présentant une faible viscosité, le lit de support a réussi à permettre la production de la géométrie complexe. L’artère a conservé sa structure pendant le dépôt, la réticulation et l’extraction (figure 3), sans qu’il soit nécessaire de modifier les codes d’impression pour incorporer des échafaudages supplémentaires. Figure 3 : Procédé de fabrication de l’artère carotide gellane à l’aide du SLAM. (A) Extrusion de gellane dans le lit de gel fluide pendant l’impression, (B) empreinte carotide complète dans le gel fluide pendant la réticulation, et (C) modèle final de l’artère carotide après prélèvement à partir du support de gel fluide. Barres d’échelle = 10 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Prise en compte du choix des matériaux utilisés pour le lit de support
Au cours de la phase de développement, diverses caractéristiques étaient requises pour le lit de soutien. Ces caractéristiques comprenaient : i) le maintien d’une structure suffisante pour suspendre le matériau extrudé; ii) capacité d’amincissement par cisaillement pour permettre à la tête d’impression de se déplacer librement dans le matériau de support; iii) restructuration rapide (propriétés auto-cicatrisantes), formant un support autour de la bio-encre déposée; iv) thermiquement stable à la température ambiante et à la température physiologique; v) un matériau neutre (c.-à-d. non chargé) relativement bioinerte, à travers une gamme de pH et d’électrolytes (espèces ioniques et concentrations), empêchant les interactions avec les cellules et les bioencres chargées; vi) non toxique; et vii) de préférence d’origine non animale.

Bien qu’il existe de nombreux matériaux biopolymères qui conservent plusieurs de ces caractéristiques inhérentes, avec une capacité à effectuer une fabrication additive 3D en suspension sans se conformer à toutes ces caractéristiques 11,26,27, l’intention ici était de produire un lit de support qui surmonterait certains problèmes pratiques associés à d’autres matériaux de support. En raison des propriétés chimiques de l’agarose et, en particulier, lorsqu’il est formulé sous forme de gel fluide particulaire, toutes ces caractéristiques ont pu être obtenues. Cela a permis d’obtenir un lit de support pouvant être utilisé sur une grande variété de bio-encres23,24,25,28. En effet, la nature bioinerte du matériau a permis de maintenir la structure imprimée in situ tout au long de la culture, permettant des échelles de temps suffisantes pour que de nombreuses bio-encres différentes se développent pleinement, sans modification de la biologie. En outre, la nature particulaire et amincissante a facilité le retrait de la construction imprimée finale, tandis que l’origine non toxique et non animale permet une traduction rapide vers la clinique, en surmontant les obstacles liés aux exigences éthiques et réglementaires.

Considérations dans le choix des matériaux pour les bio-encres
Dans la bio-impression par extrusion directe, les bio-encres sont déposées sur un lit d’impression 2D. Il est bénéfique que les solutions de bio-encre monomère aient un comportement d’amincissement par cisaillement; Cependant, pour produire des constructions haute fidélité avec des dimensions physiologiquement pertinentes, elles doivent avoir une faible thixotropie et récupérer à des viscosités suffisamment élevées pour former des filaments solides lors du dépôt 29,30,31. Avec une viscosité accrue, la pression requise pour l’extrusion est beaucoup plus élevée, influençant souvent négativement la viabilité de la cellule encapsulée31,32. La bio-impression en suspension supprime cette limitation, car le matériau extrudé est soutenu par le bain de suspension tout au long de la réticulation. Ce développement augmente considérablement la gamme de formulations de bio-encre pouvant être utilisées. Par exemple, des travaux récents ont montré l’utilisation de solutions de collagène à faible concentration imprimées dans des géométries très complexes analogues à la structure interne du cœur33,34,35. Dans les applications mentionnées dans cette méthode, l’impression embarquée a permis de choisir les encres de biomatériaux pour reproduire au mieux l’environnement physiologique auquel elles étaient destinées, plutôt que pour leur capacité à être imprimées.

Limitations de la taille de la structure
Tout au long de la littérature sur la biofabrication, il a été démontré que différents types de bio-imprimantes, pilotées par d’autres technologies de têtes d’impression, peuvent être incorporées dans les techniques de fabrication intégrées. La technologie présentée ici n’est pas différente, avec des exemples qui incluent une bioimprimante pneumatique à base de micro-extrusion (INKREDIBLE), comme démontré par Senior et al., et des bioimprimantes à base d’extrusion avec des microvalves contrôlables (3D Discovery)23. Bien que cela rende la technologie accessible à un éventail d’utilisateurs qui possèdent peut-être déjà une bio-imprimante, les limites de la taille atteignable de la structure dépendent en fin de compte des spécifications de la bio-imprimante en question. Initialement, la principale restriction à la génération de grandes structures est définie par la taille du lit d’impression, les limites des trajectoires X, Y et Z, ainsi que la taille du récipient dans lequel le gel fluide de support est contenu.

Limites de la résolution
Lors de la fabrication de structures complexes de taille micrométrique, la résolution résultante dépend fortement de la précision de l’imprimante (contrôle de la taille des pas, degré d’extrusion), du diamètre interne de la buse d’impression et d’une gamme de paramètres logiciels réglables, notamment la vitesse d’impression, la pression d’impression et la vitesse d’écoulement36. En outre, le contrôle de la taille des gouttelettes semble être essentiel pour faciliter la génération de structures à haute résolution, les meilleurs résultats étant observés dans les imprimantes d’extrusion équipées d’une microvalve contrôlable. En fin de compte, lorsque tous les paramètres sont optimisés, les résolutions d’impression peuvent être obtenues pour correspondre, voire être inférieures, au diamètre intérieur des buses d’extrusion, le filament déposé étant de l’ordre de l’échelle micrométrique37. Cela dépend toutefois de l’optimisation de tous les paramètres d’impression mentionnés précédemment, et la résolution peut être considérablement limitée par le mécanisme d’impression et la précision. L’extrusion pneumatique, par exemple, ne semble pas permettre la même résolution d’impression que l’extrusion avec une microvalve contrôlable. Il y a donc une implication potentielle sur les coûts pour atteindre la résolution d’impression maximale, car ces systèmes entraînent des dépenses considérablement accrues pour l’utilisateur.

Perspectives d’avenir et potentiel
À l’heure actuelle, il y a beaucoup d’intérêt autour de l’utilisation de procédés de fabrication en suspension pour permettre la production de structures molles complexes contenant des cellules intégrées, et il y aura sans aucun doute des progrès significatifs dans les années à venir. Des progrès continus dans l’amélioration de la résolution d’impression sont donnés, bien qu’il reste à voir à quel point cela sera nécessaire, étant donné que la majorité des systèmes biologiques sont capables de se réorganiser au niveau moléculaire. Bien que l’intérêt des médias porte sur l’utilisation de tissus imprimés en 3D pour remplacer directement les tissus humains à la suite d’une blessure ou d’une maladie, toutes les procédures médicales robustes rendues possibles par ces processus sont à quelques années38,39. Il est plus probable que l’impact de ces systèmes de culture complexes se fera sentir dans le dépistage de médicaments ou même dans leur utilisation d’outils, afin d’améliorer notre compréhension des processus biologiques38. En particulier, la biologie du développement pourrait grandement bénéficier ici, où un contrôle précis du dépôt spécial de molécules permettra aux chercheurs d’explorer le rôle des systèmes multifactoriels sur les processus de développement tissulaire.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier l’EPSRC (EP/L016346/1), le MRC et la Doctoral Training Alliance Biosciences for Health pour le financement et le soutien de ces travaux.

Materials

3D Discovery Bioprinter RegenHU BIOFACTORY Microvalve extrusion bioprinter
Agarose  Merck 9012-36-6 Material used to create fluid gel support baths 
Benchtop autoclave Prestige Medical B8L75814 Classic
Brilliant Blue G Merck 6104-58-1 Dye used to stain structures 
Calcium Chloride Dihydrate Merck  10035-04-8 Used to reticulate printed structures 
Dexamethasone Merck  D4902-25MG Used in adipogenic media
DMEM Merck D6429 Cell culture media
Duran  bottle  Merck Z305219 glass bottle 
EVOS XL Core Imaging System EVOS™ AMEX1000 Brightfield microscope with phase contrast
FBS Fisher Scientific 10500-064 Cell culture media supplement
Gellan gum Special Ingredients 5060341112638 Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model
HEPES buffer Merck H9897-10PAK Buffer for cell culture media
Indomethacin Merck I7378 Used in adipogenic media
Isobutyl-methylxanthine (IBMX) Merck I7018-100MG Used in adipogenic media
Keratinocyte growth medium Lonza 00192060 Used as media to culture keratinocytes
Low Methoxy Pectin CP Kelco LM-5CS Pectin used to make pectin/collagen blends
Penicillin-streptomycin Merck P4333-100ML Used to inhibit bacterial growth
PureCol EZ Gel solution Merck 5074 Collagen solution used to make alginate/collagen blends
Sodium Alginate Merck 9005-38-3 Alginate powder used to make alginate/collagen blends 
TrypLE select  Fisher Scientific 12563011 cell dissociation enzyme
T75 Flasks StarLab CC7682-4175 Used for culturing cells
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References

  1. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1880 (2001).
  2. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  3. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  4. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  5. Iordachescu, A., et al. An in vitro model for the development of mature bone containing an osteocyte network. Advanced Biosystems. 2 (2), 1700156 (2018).
  6. Zhang, C., et al. Hydrogel cryopreservation system: an effective method for cell storage. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3330 (2018).
  7. McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
  8. Cheng, W., Zhang, J., Liu, J., Yu, Z. Granular hydrogels for 3D bioprinting applications. View. 1 (3), 20200060 (2020).
  9. Lieben, L. The future of 3D printing of human tissues is taking shape. Nature Reviews Rheumatology. 12 (4), 191 (2016).
  10. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).
  11. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
  12. Zarrintaj, P., et al. Agarose-based biomaterials for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 187, 66-84 (2018).
  13. te Nijenhuis, K. . Thermoreversible Networks: Viscoelastic Properties and Structure of Gels. , 194-202 (1997).
  14. Norton, I. T., Jarvis, D. A., Foster, T. J. A molecular model for the formation and properties of fluid gels. International Journal of Biological Macromolecules. 26 (4), 255-261 (1999).
  15. Fernández Farrés, I., Moakes, R. J. A., Norton, I. T. Designing biopolymer fluid gels: A microstructural approach. Food Hydrocolloids. 42, 362-372 (2014).
  16. Cooke, M. E., et al. Structuring of hydrogels across multiple length scales for biomedical applications. Advanced Materials. 30 (14), 1705013 (2018).
  17. Foster, N. C., Allen, P., El Haj, A. J., Grover, L. M., Moakes, R. J. A. Tailoring therapeutic responses via engineering microenvironments with a novel synthetic fluid gel. Advanced Healthcare Materials. 10 (16), 2100622 (2021).
  18. Ellis, A. L., Norton, A. B., Mills, T. B., Norton, I. T. Stabilisation of foams by agar gel particles. Food Hydrocolloids. 73, 222-228 (2017).
  19. Ghebremedhin, M., Seiffert, S., Vilgis, T. A. Physics of agarose fluid gels: Rheological properties and microstructure. Current Research in Food Science. 4, 436-448 (2021).
  20. Garrec, D. A., Norton, I. T. Understanding fluid gel formation and properties. Journal of Food Engineering. 112 (3), 175-182 (2012).
  21. Garrec, D. A., Guthrie, B., Norton, I. T. Kappa carrageenan fluid gel material properties. Part 1: Rheology. Food Hydrocolloids. 33 (1), 151-159 (2013).
  22. Adams, S., Frith, W. J., Stokes, J. R. Influence of particle modulus on the rheological properties of agar microgel suspensions. Journal of Rheology. 48 (6), 1195-1213 (2004).
  23. Senior, J. J., Cooke, M. E., Grover, L. M., Smith, A. M. Fabrication of complex hydrogel structures using suspended layer additive manufacturing (SLAM). Advanced Functional Materials. 29 (49), 1904845 (2019).
  24. Moakes, R. J. A., et al. A suspended layer additive manufacturing approach to the bioprinting of tri-layered skin equivalents. APL Bioengineering. 5 (4), 046103 (2021).
  25. Moxon, S. R., et al. Suspended manufacture of biological structures. Advanced Materials. 29 (13), 1605594 (2017).
  26. Noor, N., et al. 3D Printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
  27. Compaan, A. M., Song, K., Huang, Y. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (6), 5714-5726 (2019).
  28. Moxon, S. R., et al. Blended alginate/collagen hydrogels promote neurogenesis and neuronal maturation. Materials Science and Engineering: C. 104, 109904 (2019).
  29. Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
  30. Chimene, D., Lennox, K. K., Kaunas, R. R., Gaharwar, A. K. Advanced bioinks for 3D printing: a materials science perspective. Annals of Biomedical Engineering. 44 (6), 2090-2102 (2016).
  31. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  32. Rutz, A. L., Lewis, P. L., Shah, R. N. Toward next-generation bioinks: Tuning material properties pre- and post-printing to optimize cell viability. MRS Bulletin. 42 (8), 563-570 (2017).
  33. Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomedical Materials. 10 (3), 034002 (2015).
  34. Zhou, K., Sun, Y., Yang, J., Mao, H., Gu, Z. Hydrogels for 3D embedded bioprinting: a focused review on bioinks and support baths. Journal of Materials Chemistry B. 10 (12), 1897-1907 (2022).
  35. Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  36. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-Sabah, A., Whitaker, I. S. Printability’ of candidate biomaterials for extrusion based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700264 (2017).
  37. Hinton, T. J., Lee, A., Feinberg, A. W. 3D bioprinting from the micrometer to millimeter length scales: Size does matter. Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 31-37 (2017).
  38. Seoane-Viaño, I., Trenfield, S. J., Basit, A. W., Goyanes, A. Translating 3D printed pharmaceuticals: From hype to real-world clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 553-575 (2021).
  39. Jovic, T. H., Combellack, E. J., Jessop, Z. M., Whitaker, I. S. 3D bioprinting and the future of surgery. Frontiers in Surgery. 7, 609836 (2020).

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Senior, J. J., Moakes, R. J. A., Cooke, M. E., Moxon, S. R., Smith, A. M., Grover, L. M. Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (195), e64458, doi:10.3791/64458 (2023).
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