JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Agarose vloeibare gels gevormd door afschuifverwerking tijdens gelation voor gesuspendeerde 3D-bioprinting

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/64458
, , , , ,
1Department of Pharmacy,University of Huddersfield, 2School of Chemical Engineering,University of Birmingham, 3Chemical and Biological Engineering,University of Colorado Boulder, 4School of Biological Sciences,University of Manchester

Summary

Afschuifverwerking tijdens hydrogelvorming resulteert in de productie van microgel-suspensies die dun scheren maar snel herstructureren na het verwijderen van schuifkrachten. Dergelijke materialen zijn gebruikt als een ondersteunende matrix voor het bioprinten van complexe, met cellen beladen structuren. Hier worden methoden beschreven die worden gebruikt om het ondersteunende bed en compatibele bioinks te vervaardigen.

Abstract

Het gebruik van granulaire matrices om onderdelen te ondersteunen tijdens het bioprintproces werd voor het eerst gerapporteerd door Bhattacharjee et al. in 2015, en sindsdien zijn er verschillende benaderingen ontwikkeld voor de voorbereiding en het gebruik van ondersteunende gelbedden in 3D-bioprinting. Dit artikel beschrijft een proces om microgelsuspensies te vervaardigen met behulp van agarose (bekend als vloeibare gels), waarbij deeltjesvorming wordt geregeld door de toepassing van afschuiving tijdens gelatie. Een dergelijke verwerking produceert zorgvuldig gedefinieerde microstructuren, met daaropvolgende materiaaleigenschappen die duidelijke voordelen bieden als het inbedden van printmedia, zowel chemisch als mechanisch. Deze omvatten het gedragen als visco-elastische vastestofachtige materialen bij zero shear, het beperken van diffusie over lange afstand en het demonstreren van het karakteristieke schuifverdunnende gedrag van flocculated systemen.

Bij het verwijderen van schuifspanning hebben vloeibare gels echter het vermogen om hun elastische eigenschappen snel te herstellen. Dit gebrek aan hysterese is direct gekoppeld aan de gedefinieerde microstructuren waarnaar eerder werd verwezen; vanwege de verwerking vergemakkelijken reactieve, niet-gelled polymeerketens op de deeltjesinterface interdeeltjesinteracties – vergelijkbaar met een klittenbandeffect. Dit snelle herstel van elastische eigenschappen maakt het mogelijk om onderdelen met een hoge resolutie te bioprinten uit biomaterialen met een lage viscositeit, omdat een snelle reformatie van het ondersteuningsbed de bioink in situ vasthoudt en zijn vorm behoudt. Verder is een voordeel van agarose vloeibare gels de asymmetrische geleer/smeltovergangen (gelatietemperatuur van ~30 °C en smelttemperatuur van ~90 °C). Deze thermische hysterese van agarose maakt het mogelijk om het biogeprinte deel ter plaatse te printen en te kweken zonder dat de ondersteunende vloeibare gel smelt. Dit protocol laat zien hoe agarose-vloeistofgels moeten worden vervaardigd en demonstreert het gebruik ervan ter ondersteuning van de productie van een reeks complexe hydrogelonderdelen binnen de productie van additieve lagen (SLAM).

Introduction

Hydrogels zijn perfecte materialen om te gebruiken als ondersteuning voor celgroei1. Afhankelijk van het materiaal dat wordt gebruikt, gelen ze via zachte mechanismen die de levensvatbaarheid van de cel niet in gevaar brengen 2,3. Het hoge watergehalte (meestal >90%) betekent dat voedingsstoffen en zuurstof gemakkelijk in het materiaal kunnen diffunderen en afvalproducten van het celmetabolisme diffunderen4. Als zodanig is aangetoond dat de levensvatbaarheid van cellen behouden blijft voor perioden van meer dan 1 jaar5, en er zijn nu voorbeelden van hydrogels die worden gebruikt om cellen op te slaan of te “pauzeren” voor toekomstig therapeutisch gebruik6. Ze zijn op grote schaal gebruikt in tissue engineering voor de productie van weefselachtige structuren, maar het gebruik ervan wordt meestal beperkt door de moeilijkheid om zowel de structuur als de samenstelling van het materiaal te beheersen. Historisch gezien is de sterkte van hydrogel relatief laag (in verhouding tot veel harde weefsels), vanwege het hoge watergehalte en de lage volumes die worden ingenomen door de polymeermatrix die de structuur vormt. Bovendien bieden veel routes naar gelatie (thermisch, ionotroop, fibrillogenese) een redelijk langzame kinetiek, wat betekent dat hun mechanische eigenschappen de neiging hebben zich gestaag te ontwikkelen met de tijd. Met uitzondering van interpenetratienetwerken resulteren lage mechanische stijfheid en langzame uithardingstijden vaak in bioinks die niet in staat zijn om vrij te staan bij afzetting, de neiging hebben om te “inzakken” en de definitie verliezen wanneer ze in eerste instantie worden geëxtrudeerd.

In een poging om dit belangrijke probleem op te lossen, zijn ingebedde druktechnieken ontwikkeld die ondersteuning bieden tijdens het afdrukken, terwijl de mechanische eigenschappen van de constructie zich ontwikkelen 7,8. Zodra de microstructuur van de gel volledig is ontwikkeld en de mechanische eigenschappen optimaal zijn bereikt, kan de ondersteuningsmatrix worden verwijderd, meestal door voorzichtig wassen of smelten van de ondersteuningsfase. Het eerste werk aan deze aanpak maakte gebruik van een viskeuze pluronische dispersie waarin de secundaire fase werd verdeeld9. Meer recent gebruikten Bhattacharjee et al. gels in de vorm van gegranuleerd carbopol om aan te tonen dat arrays van cellen konden worden gesuspendeerd in de ondersteunende gel10. Vervolgens rapporteerden Hinton et al. over de extrusie van op gel gebaseerde materialen die cellen bevatten in een ondersteuningsbed dat bestond uit een microgelsuspensie gevormd uit korrelige gelatine11. Na extrusie van de celbevattende hydrogel en de daaropvolgende uitharding, werd de gelatine verwijderd door zachte verwarming van het steunbad, waardoor het smelten van de gelatine mogelijk werd. Helaas heeft dit proces nog steeds verschillende beperkingen. De chemische structuur van gelatine in vergelijking met collageen (dus omdat het een gehydrolyseerde vorm van collageen is) is bijvoorbeeld zodanig dat veel chemische stoffen over de ruggengraat kunnen interageren met biologische entiteiten; Een resterende ondersteuningsmatrix zou dus kunnen interfereren met stroomafwaartse biologische processen. Bovendien vormen dierlijke producten een beperkend nut bij het zoeken naar de vertaalbaarheid van een technologie. Dit creëert uitdagingen als het gefabriceerde onderdeel bedoeld is om klinisch te worden gebruikt, of zelfs als het moet worden gebruikt om fundamentele biologische vragen te beantwoorden, waarbij deze oppervlakteverontreiniging een aanzienlijk probleem kan veroorzaken.

Vervolgens hebben we een verfijnd proces gecreëerd dat de gesuspendeerde productie van hydrogels mogelijk maakt, binnen een ondersteunende matrix, die geen lading heeft onder fysiologische omstandigheden en wordt gevormd uit niet-dierlijke materialen. Hoewel het proces kan worden gebruikt met een reeks biopolymere ondersteuningen, biedt agarose een materiaal dat inert is voor biologische interacties omdat het op suiker is gebaseerd en neutraal geladen is bij fysiologische pH12,13. In plaats van een reeds bestaande gel te fragmenteren, wordt het ondersteuningsmateriaal gevormd door het aanbrengen van afschuiving tijdens gelation14,15,16. Dit produceert een matrix van deeltjes die dendroonachtige kenmerken vertonen aan hun oppervlak en worden gedispergeerd in een secundaire matrix van ongegelled polymeer17,18. Het resultaat is een materiaal met interessante materiaaleigenschappen 19,20,21,22 dat op een vergelijkbare manier kan worden afgeschud als eerder gerapporteerde korrelige gels, maar de viscositeit sneller herstelt wanneer afschuiving wordt verwijderd 23. Zodra het celdragende materiaal dat in de ondersteunende matrix is geëxtrudeerd, volledig is gerijpt, kan de ondersteuningsmatrix door zachte agitatie worden verwijderd voordat deze in cultuur wordt geplaatst. Het is aangetoond dat het mogelijk is om dit proces te gebruiken om materialen met complexe structuren te produceren en de biologische structuren van zowel de huid als het osteochondrale gebied samen te vatten23,24,25. Dit methodedocument beschrijft in detail hoe het ondersteunende materiaal moet worden vervaardigd en belicht geschikte bioinks die worden gebruikt in een verscheidenheid aan complexe structuren.

Protocol

OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt. 1. Voorbereiding van het vloeibare gel suspensiebed Bereid 1.000 ml gedispergeerde agarose (0,5% m/v) door 5 g agarosepoeder toe te voegen aan 1.000 ml ultrapuur water (type 1, >18 mΩ·cm-1) in een glazen fles van 2.000 ml. Voeg een magnetische roerstaaf van 70 mm toe aan het waterige mengsel en zet de dop van de fles vast door eerst volledig aan te draaien en vervolgens een kwartslag los te maken. Los het mengsel op en steriliseer het door de glazen fles in de mand van de autoclaaf te plaatsen, het deksel te sluiten en een cyclus van 15 minuten uit te voeren bij 121 °C en 1 bar.OPMERKING: Dit protocol wordt altijd gebruikt voor autoclaveroplossingen in verdere stappen. Haal de fles uit de autoclaaf zodra de autoclaaf is afgekoeld tot 80 °C en plaats deze op een magneetroerder (onverwarmd), met het roeren ingesteld op 800 tpm.LET OP: De fles en de vloeistof blijven heet. Koel de sol onder omgevingsomstandigheden, onder constant roeren, totdat de temperatuur lager is dan de T-gel (geleerpunt), 32 °C. Haal de fles uit de roerder en bewaar deze bij 4 °C.OPMERKING: De vloeibare gel kan worden bewaard totdat deze nodig is. 2. Bereiding van bioinks Bereid een bioink op basis van gelan op basis van gelan met een 1% (w/w) sol van lage acyl gellangom in ultrapuur water (Type 1, >18 mΩ·cm-1).Weeg 0,5 g gellanpoeder af in een weegboot. Voeg 49,5 g ultrapuur water toe aan een glazen fles van 100 ml, samen met een magnetische roerder. Vouw de weegboot met gellankracht doormidden en voeg het poeder langzaam toe aan het water, terwijl u voortdurend roert. Los de sol op en steriliseer deze met behulp van een autoclaaf en laat hem afkoelen tot 20 °C. Bewaar de bioink bij 4 °C tot verder gebruik. Bereid een pectine-collageen gemengde bioink in ultrapuur water (Type 1, >18 mΩ·cm-1).Bereid bouillon 5% (m/v) methoxyarme pectineoplossingen door 2,5 g pectinepoeder in een weegboot af te wegen. Voeg 50 ml ultrapuur water toe aan een glazen fles van 100 ml, samen met een magnetische roerder. Vouw de weegboot met pectinekracht doormidden en voeg het poeder langzaam toe aan het water, terwijl u voortdurend roert. Autoclaaf het waterige mengsel en koel af tot 20 °C. Bereid 1:1 en 2:1 pectine-collageenmengsels door respectievelijk 3 ml pectine-oplossing toe te voegen aan 3 ml collageenoplossing of door 4 ml pectine-oplossing toe te voegen aan 2 ml collageenoplossing. Meng de mengsels voorzichtig met een pipet, door het mengsel 10x op te zuigen en te doseren.OPMERKING: Deze procedure kan het beste worden uitgevoerd met behulp van koude materialen op ijs om voortijdige gelatie van het collageen te voorkomen. Voorkoeling van pectine en collageen kan worden bereikt door het vóór het mengen bij 4 °C te bewaren. Bewaren bij 4 °C tot verder gebruik. Bereid een alginaat-collageen gemengde bioink in ultrapuur water (Type 1, >18 mΩ·cm-1).Weeg 2 g alginaatpoeder af in een weegboot. Voeg 50 ml ultrapuur water toe aan een glazen fles van 100 ml, samen met een magnetische roerder. Vouw de weegboot met alginaatkracht doormidden en voeg het poeder langzaam toe aan het water, terwijl u voortdurend roert. Verwarm de dispersie onder voortdurend roeren tot 60 °C totdat het alginaat volledig is opgelost (heldere, lichtbruine vloeistof) en koel vervolgens af tot 20 °C. Verdun de alginaatoplossing met celkweekmedium zoals Dulbecco’s gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM) door 25 ml van de alginaatoplossing toe te voegen aan 25 ml DMEM. Bereid alginaat-collageenmengsels (1:1) door 3 ml van de alginaat/DMEM-oplossing toe te voegen aan 3 ml collageenoplossing. Meng de mengsels voorzichtig met een pipet door het mengsel 10x op te zuigen en te doseren en bewaar bij 4 °C.OPMERKING: Deze procedure kan het beste worden uitgevoerd met behulp van koude materialen op ijs om voortijdige gelatie van het collageen te voorkomen. Voorkoeling van pectine en collageen kan worden bereikt door het vóór het mengen bij 4 °C te bewaren. 3. Reologische karakterisering van bioinks Zet de reometer aan, plaats gekartelde geometrieën van 40 mm en laat 30 minuten staan. Nul de spleethoogte van de rheometer met behulp van de nul-spleethoogtefunctie. Voeg ~ 2 ml monster toe aan de bodemplaat en verlaag de bovenste geometrie om een spleethoogte van 1 mm te creëren. Snijd het monster bij door overtollig materiaal dat tussen de platen vandaan wordt verdreven te verwijderen. Gebruik hiervoor een platte, niet-schurende rand om overtollig vocht weg te trekken van de opening en op te nemen met tissuepapier.OPMERKING: Stap 3.2-3.4 worden herhaald om het monster vóór elk van de volgende stappen te wijzigen. Voer viscometrieprofielen uit om de injecteerbaarheid van de bioink te bepalen.Selecteer viscometrietest uit de gebruikersopties . Voer de parameters in voor een afschuifsnelheidsgestuurde hellingtest: 0,1 tot 500 s-1, met een hellingstijd van 1 min. Herhaal de viscometriehellingtest op nieuwe monsters onder spanningscontrole, waarbij gebruik wordt gemaakt van de bovenste en onderste spanningen die zijn bepaald aan de hand van de afschuifsnelheidsgestuurde hellingtest in stap 3.5.2. Voer kleine vervormingstests uit om de geleereigenschappen van de bio-inkt te bepalen.Selecteer oscillerende tests uit de gebruikersopties . Voer parameters in een enkele frequentietest in onder constante spanning: frequentie 1 Hz, spanning 0,5% gedurende 1 uur, terwijl de inkt gels. Voer in situ amplitude- en frequentiemetingen uit op gelled monsters.Selecteer oscillerende test uit de gebruikersopties . Selecteer amplitude sweep en voer de parameters in voor een amplitude sweep-test die wordt gecontroleerd: 0,01 tot 500%, bij een constante frequentie van 1 Hz . Laad een nieuw monster en selecteer oscillerende test uit de gebruikersopties . Selecteer vervolgens de frequentietest en invoerfrequentieparameters tussen 0,01 en 10 Hz en een stam die zich binnen het lineaire visco-elastische gebied (LVR) van de spectra bevindt, bepaald op basis van de amplitude-veeggegevens die zijn verkregen in stap 3.7.2 (meestal een waarde tussen 50% en 80% van de LVR). 4. 3D-structuren ontwerpen en printen met een 3D-bioprinter Start CAD-software om het genereren van een CAD-model te starten.Selecteer Extra | Materialen in de CAD-software om de printparameters voor de gekozen bioink te definiëren. Invoerparameters voor afdrukken die relevant zijn voor de gebruikte printer; Voer voor de 3D Discovery bijvoorbeeld de geschatte filamentdiameter (~200-500 μm voor de meeste bioinks) in op het tabblad dikte om de Z-dikte van elke laag te bepalen.OPMERKING: Delaminatie van de uiteindelijke constructie is indicatief voor de noodzaak om de diktewaarde te verhogen, terwijl verlies van resolutie de noodzaak benadrukt om de dikte te verminderen. Ontwerp de gewenste structuur laag voor laag met behulp van de laagtabbladen in de software . Groepeer de lagen met behulp van het tabblad Groeperen en wijs elke laag toe aan een niveau op het Z-vlak met behulp van het tabblad Niveau .Als u bijvoorbeeld een roosterstructuur wilt genereren (met behulp van een met alginaat-collageen gemengde bioink die in stap 2.3 is voorbereid), maakt u één laag met de filamenten langs de x-as en een tweede laag met de filamenten langs de y-as. Wijs beide toe aan een afzonderlijk niveau. Bepaal op het tabblad Groeperen de bouwhoogte door het aantal herhaalde eenheden in de structuur te selecteren. Klik op het gereedschap Genereren om een G-code voor het ontwerp te maken en een 3D-weergave van de structuur weer te geven. Sluit BioCAD en start de 3D Discovery human-machine interface (HMI)-software om het afdrukproces te starten.Monteer de printkop volgens de instructies van de fabrikant. Monteer de microvalve op de printkop en schroef het gekozen extrusiemondstuk erin. Klik op de functie Naaldlengtemeting om de printkop te kalibreren. Laad een kweekvat (bijvoorbeeld een 6-putsplaat) op het printplatform. Aliquoteer de bioink in de printcartridge en schroef deze in de printkop boven de microklep. Sluit de geassembleerde printkop aan op het pneumatische druksysteem en selecteer de printkop op de HMI om in te schakelen. Klik op de druk controleren om de extrusiedruk af te stemmen. Zodra een geschikte druk is geselecteerd (~30-120 kPa , afhankelijk van de gewenste resolutie), opent u de eerder gegenereerde G-code en klikt u op Uitvoeren om het afdrukproces te starten. 5. Bereiding van huidanalogen Kweek menselijke dermale fibroblasten (HDF’s) en van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC’s) in DMEM aangevuld met foetaal runderserum (FBS) (10%), HEPES-buffer (2,5%) en penicilline / streptomycine (1%) in T75-kolven totdat 90% confluentie is bereikt. Kweek menselijke epidermale keratinocyten (HEK’s) in keratinocytengroeimedia (KGM) totdat 70% -80% confluentie is bereikt. Bewaar alle cellen onder omstandigheden van 37 °C, 5% CO2 en 95% lucht in een couveuse tijdens de kweek. Voor de bereiding van HDF’s en ADSC’s voor dermale en vetbioinks, was de cellen door voorzichtig 3 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in kolven te pipetteren, kantel de kolf om de PBS over de cellen te draaien en aspirateer, waarbij u ervoor zorgt dat de aangehechte cellen niet worden verstoord.Om de cellen op te tillen, pipetteer 3 ml 1x celdissociatie-enzym in de kolf om de cellen te bedekken en plaats de kolf gedurende 3 minuten in een couveuse, waarbij de kolf stevig tegen de palm van de hand wordt getikt om de cellen los te maken. Neutraliseer de werking van het enzym met behulp van 6 ml complete DMEM.OPMERKING: Incubeer nog eens 2 minuten als de cellen na het tikken vast blijven zitten. Voor de bereiding van de dermale en vetbioinks, pipetteer de celsuspensies in afzonderlijke buizen van 15 ml en neem 10 μL van elk voor celtelling met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de resterende celsuspensies op 300 × g gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. Zuig het supernatant op, zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord, voeg de juiste polymeeroplossing toe (bereid in stap 2.2) en meng met behulp van zachte stimulatie door pipetteren bij de volgende dichtheden:Voor de vetlaag, pipet 5 × 105 ADSCs mL-1 per 1:1 collageen tot pectine mengsel. Voor de papillaire laag, pipet 3 × 106 HDFs mL-1 per 2:1 collageen tot pectine mengsel. Voor de reticulaire laag, pipet 1,5 × 106 HDFs ml-1 per 2:1 collageen tot pectine mengsel. Om af te drukken, laadt u elke bioink in een afzonderlijke cartridge en drukt u de constructie af in de ondersteunende vloeibare gel in een glazen petrischaaltje volgens de instructies in rubriek 4.Zodra het afdrukken is voltooid, injecteert u 2 ml CaCl 2∙2H2O rond het construct en 3 ml adipogene media (volledige DMEM aangevuld met 500 μM isobutyl-methylxanthine [IBMX], 50 μM indomethacine en 1 μM dexamethason) in de vloeibare gel met behulp van een spuit en naald. Plaats ‘s nachts in een couveuse. Verwijder de volgende dag de constructie uit het ondersteuningsbad met behulp van een spatel, was voorzichtig in PBS en kweek gedurende 14 dagen in adipogene medium in een plaat met 6 putten. Verwijder na 14 dagen voldoende medium om een lucht-vloeistofinterface aan het oppervlak van het construct te creëren en zaai 2 × 106 keratinocyten bovenop het construct om een epidermale laag te creëren. Kweek verder gedurende 1 week voorafgaand aan de analyse. 6. Voorbereiding van halsslagadermodel Plaats de bioink-oplossing van de gellanggom (zoals bereid in stap 2.1) in een printercartridge. Druk het halsslagadermodel af in een petrischaaltje met het vloeibare geldragermateriaal volgens de afdrukinstructies in rubriek 4. Zodra het afdrukken is voltooid, injecteert u 2 ml 200 mM CaCl 2∙2H2 O rond deconstructie met behulp van een spuit en naald. Verwijder na minimaal 3 uur de constructie uit het steunbad met een spatel en was voorzichtig in PBS.

Representative Results

Alginaat en type I collageen bioinkDe printresolutie (geregistreerd als functie van de filamentdiameter) bleek direct instelbaar te zijn via veranderingen in de extrusiedruk (figuur 1A-C). De extrusiedruk en de printresolutie waren direct gerelateerd aan de kleinste filamentdiameters die via printen bij een extrusiedruk van 30 kPa werden gegenereerd. Interessant is dat bij een extrusiedruk van 30 kPa filamenten konden worden gegenereerd die overeenkwamen met de binnendiameter van het extrusiesproeier (gemiddelde filamentdiameter: 323 μm ± 50 μm; nozzlediameter: 300 μm), wat suggereert dat een “maximale resolutie” kan worden bereikt. Bovendien kunnen de afdrukparameters voor deze resolutie met succes worden toegepast op het genereren van een alginaat / collageen vaatbuis die kan worden geëxtraheerd en geperfuseerd (figuur 1D). Figuur 1: Genereren van afdrukken met hoge resolutie met SLAM. Het aanpassen van de printresolutie van alginaat/collageenroosters als functie van de filamentdiameter via extrusie bij (A) 30 kPa, (B) 60 kPa en (C) 120 kPa. (D) Generatie van een alginaat/collageen vaatbuis. Schaalstaven = 400 μm (A-C), 10 mm (D). Afkorting: SLAM = suspended layer additive manufacture. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. HuidanalogenSLAM werd ook gebruikt om een huidachtige structuur te creëren (figuur 2A) met behulp van een bioink gevormd uit een mengsel van collageen I en pectine. Om een gradiënt van mechanische eigenschappen te bereiken die vergelijkbaar zijn met die in de huid, werden verschillende verhoudingen pectine en collageen gebruikt in de dermale (5% w / w pectine gemengd op 2: 1 met een 5 mg ∙ ml − 1 collageenvoorraad) en hypodermale (5% w / w pectine gemengd op 1: 1 met een 5 mg ∙ ml−1 collageenvoorraad) lagen. De resulterende structuur (figuur 2Bi-Bii) was goed geïntegreerd na onderdompeling in DMEM, zonder tekenen van delaminatie. Belangrijk is dat er een hoge mate van levensvatbaarheid van de cellen was in de hele structuur (figuur 2Biii) na een periode van 14 dagen kweek. Interessant is dat in de loop van de cultuurperiode de materialenverstijfden 24, wat wijst op een verbouwing van het materiaal. Figuur 2: Productie van een huidachtige structuur. (A) Een schema dat laat zien hoe het SLAM-proces werd gebruikt om een gelaagde structuur te produceren die was ingebed in menselijke dermale fibroblasten. Het suspensiebed hier werd vervaardigd uit deeltjes gevormd uit agarose, terwijl de hypodermale en dermale lagen werden gevormd met verschillende verhoudingen pectine en collageen I. (B) De gelaagde structuur was bedoeld om de drielaagse structuur van de huid weer te geven (i). Met succes bij het repliceren van deze structuur (ii), werden hoge niveaus van levensvatbaarheid van cellen opgemerkt in de monsters, zoals aangetoond door calceïne-AM-kleuring (iii). Schaalbalk = 5 mm (Bii). Afkorting: SLAM = suspended layer additive manufacture. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. HalsslagaderOm de grenzen van de methode te verleggen, werd een selectie van complexere prenten geproduceerd. In een dergelijk voorbeeld werd een gespleten halsslagader geprint met behulp van 1% gellanbioink (figuur 3A), die vervolgens werd verknoopt door extrusie van 200 mM CaCl2 in het wervelgelbed (figuur 3B) en eenvoudig uit de steun werd getild na gelatie (figuur 3C). Ondanks dat precursorprintoplossingen een lage viscositeit vertoonden, was het ondersteunende bed succesvol in het mogelijk maken van de productie van de complexe geometrie. De slagader behield zijn structuur tijdens afzetting, crosslinking en extractie (figuur 3), zonder de noodzaak om printcodes te wijzigen om extra steigers op te nemen. Figuur 3: Fabricageproces van gellan halsslagader met behulp van SLAM. (A) Extrusie van gellan in het vloeibare gelbed tijdens het afdrukken, (B) voltooide halsslagaderafdruk in de vloeibare gel tijdens crosslinking, en (C) definitief halsslagadermodel na ophalen van vloeistofgelondersteuning. Schaalstaven = 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Overweging van de selectie van materialen die worden gebruikt voor het ondersteunende bed
Tijdens de ontwikkelingsfase waren er verschillende kenmerken vereist van het ondersteunende bed. Deze kenmerken omvatten: i) het handhaven van voldoende structuur om het geëxtrudeerde materiaal op te hangen; ii) afschuifverdunningscapaciteit om de printkop vrij door het ondersteunende materiaal te laten bewegen; iii) snelle herstructurering (zelfherstellende eigenschappen), het vormen van draagvlak rond de afgezette bioink; iv) thermisch stabiel bij zowel kamertemperatuur als fysiologische temperaturen; v) neutraal (d.w.z. ongeladen) materiaal dat relatief bio-inert is, over een reeks pH- en elektrolyten (ionische soorten en concentraties), waardoor interacties met cellen en geladen bioinks worden voorkomen; vi) niet-toxisch; en, vii) bij voorkeur van een niet-dierlijke bron.

Hoewel er veel biopolymeermaterialen zijn die verschillende van deze inherente kenmerken behouden, met een capaciteit om gesuspendeerde 3D-additieve productie uit te voeren zonder aan al deze kenmerken te voldoen 11,26,27, was het de bedoeling hier om een ondersteunend bed te produceren dat bepaalde praktische problemen in verband met andere ondersteunende materialen zou overwinnen. Vanwege de chemische eigenschappen van agarose en, in het bijzonder, wanneer geformuleerd als een deeltjesvloeistofgel, konden al deze eigenschappen worden verkregen. Dit maakte een ondersteunend bed mogelijk dat kon worden gebruikt voor een breed scala aan bioinks23,24,25,28. De bio-inerte aard van het materiaal bood inderdaad het potentieel om de geprinte structuur in situ gedurende de hele cultuur te behouden, waardoor voldoende tijdschalen mogelijk waren voor veel verschillende bioinks om zich volledig te ontwikkelen, zonder veranderingen in de biologie. Bovendien maakte de fijnstof, dunner wordende aard het gemakkelijk om uit de uiteindelijke gedrukte constructie te verwijderen, terwijl de niet-toxische, niet-dierlijke oorsprong het potentieel biedt voor snelle vertaling naar de kliniek, waardoor barrières met betrekking tot ethische en wettelijke vereisten worden overwonnen.

Overwegingen bij de keuze van materialen voor de bioinks
Bij direct-extrusie bioprinting worden bioinks op een 2D-printbed gedeponeerd. Het is gunstig dat monomeer bioink-oplossingen afschuifverdunnend gedrag hebben; Om echter high-fidelity-constructies met fysiologisch relevante afmetingen te produceren, moeten ze een lage thixotropie hebben en zich herstellen tot voldoende hoge viscositeiten zodat ze vaste filamenten vormen bij afzetting 29,30,31. Bij verhoogde viscositeit is de druk die nodig is voor extrusie veel hoger, wat vaak een negatieve invloed heeft op de levensvatbaarheid van ingekapselde cellen31,32. Suspensiebioprinting neemt deze beperking weg, omdat het geëxtrudeerde materiaal tijdens de crosslinking wordt ondersteund door het suspensiebad. Deze ontwikkeling vergroot het scala aan bioink-formuleringen die kunnen worden gebruikt enorm. Recent werk heeft bijvoorbeeld aangetoond dat het gebruik van collageenoplossingen met een lage concentratie wordt afgedrukt in zeer complexe geometrieën analoog aan de interne structuur van het hart33,34,35. In de toepassingen die in deze methode worden genoemd, maakte ingebed afdrukken het mogelijk om biomateriaalinkten te kiezen om de fysiologische omgeving waarvoor ze bedoeld waren het beste te repliceren, in plaats van voor hun vermogen om te worden afgedrukt.

Beperkingen in structuurgrootte
In de biofabricageliteratuur is aangetoond dat verschillende soorten bioprinters, aangedreven door alternatieve printkoptechnologieën, kunnen worden opgenomen in ingebedde productietechnieken. De hier gedemonstreerde technologie is niet anders, met voorbeelden zoals een pneumatische micro-extrusie-gebaseerde bioprinter (INKREDIBLE), zoals gedemonstreerd door Senior et al., en extrusie-gebaseerde bioprinters met controleerbare microkleppen (3D Discovery)23. Hoewel dit de technologie toegankelijk maakt voor een reeks gebruikers die mogelijk al een bioprinter bezitten, zijn beperkingen op de haalbare grootte van de structuur uiteindelijk afhankelijk van de specificaties van de bioprinter in kwestie. Aanvankelijk wordt de belangrijkste beperking op het genereren van grote structuren bepaald door de grootte van het printbed, de grenzen van X-, Y- en Z-trajecten en ook de grootte van het vat waarin de ondersteunende vloeistofgel zich bevindt.

Beperkingen in resolutie
Bij het vervaardigen van ingewikkelde structuren van micrometerformaat is de resulterende resolutie sterk afhankelijk van de precisie van de printer (controle over de stapgrootte, de mate van extrusie), de interne diameter van het printmondstuk en een reeks instelbare softwareparameters, waaronder afdruksnelheid, afdrukdruk en stroomsnelheid36. Bovendien lijkt controle over de druppelgrootte van cruciaal belang te zijn om het genereren van structuren met een hoge resolutie te vergemakkelijken, met de beste resultaten waargenomen in extrusieprinters met een controleerbare microklep. Uiteindelijk, wanneer alle parameters zijn geoptimaliseerd, kunnen printresoluties worden bereikt die overeenkomen met, of zelfs kleiner zijn dan, de binnendiameter van extrusiesproeiers, met het gedeponeerde filament in de orde van grootte van de micrometerschaal37. Dit is echter afhankelijk van de optimalisatie van alle eerder genoemde afdrukparameters en de resolutie kan aanzienlijk worden beperkt door het afdrukmechanisme en de precisie. Pneumatische extrusie lijkt bijvoorbeeld niet dezelfde afdrukresolutie mogelijk te maken als extrusie met een regelbare microklep. Er is dus een potentiële kostenimplicatie om de maximale afdrukresolutie te bereiken, aangezien dergelijke systemen aanzienlijk hogere kosten voor de gebruiker met zich meebrengen.

Toekomstperspectieven en potentieel
Op dit moment is er veel belangstelling voor het gebruik van opgeschorte productieprocessen om de productie van complexe zachte structuren met ingebedde cellen mogelijk te maken, en er zal de komende jaren ongetwijfeld aanzienlijke vooruitgang worden geboekt. Voortdurende vooruitgang in het verbeteren van de afdrukresolutie wordt gegeven, hoewel het nog maar de vraag is hoe noodzakelijk dit zal zijn, gezien het feit dat de meeste biologische systemen in staat zijn om zichzelf op moleculair niveau te herschikken. Hoewel de focus van de interesse in de media ligt rond het gebruik van 3D-geprinte weefsels om menselijke weefsels direct te vervangen na letsel of ziekte, zijn alle robuuste medische procedures die door deze processen mogelijk worden gemaakt enkele jaren verwijderd38,39. Het is waarschijnlijker dat de impact van deze complexe kweeksystemen zal zijn bij het screenen van geneesmiddelen of zelfs als hulpmiddelen zal worden gebruikt, om ons begrip van biologische processen te vergroten38. In het bijzonder zou ontwikkelingsbiologie hier veel baat bij kunnen hebben, waar nauwkeurige controle over de speciale afzetting van moleculen onderzoekers in staat zal stellen de rol van multifactoriële systemen op weefselontwikkelingsprocessen te onderzoeken.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen graag de EPSRC (EP/L016346/1), MRC en de Doctoral Training Alliance Biosciences for Health bedanken voor de financiering en ondersteuning van dit werk.

Materials

3D Discovery Bioprinter RegenHU BIOFACTORY Microvalve extrusion bioprinter
Agarose  Merck 9012-36-6 Material used to create fluid gel support baths 
Benchtop autoclave Prestige Medical B8L75814 Classic
Brilliant Blue G Merck 6104-58-1 Dye used to stain structures 
Calcium Chloride Dihydrate Merck  10035-04-8 Used to reticulate printed structures 
Dexamethasone Merck  D4902-25MG Used in adipogenic media
DMEM Merck D6429 Cell culture media
Duran  bottle  Merck Z305219 glass bottle 
EVOS XL Core Imaging System EVOS™ AMEX1000 Brightfield microscope with phase contrast
FBS Fisher Scientific 10500-064 Cell culture media supplement
Gellan gum Special Ingredients 5060341112638 Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model
HEPES buffer Merck H9897-10PAK Buffer for cell culture media
Indomethacin Merck I7378 Used in adipogenic media
Isobutyl-methylxanthine (IBMX) Merck I7018-100MG Used in adipogenic media
Keratinocyte growth medium Lonza 00192060 Used as media to culture keratinocytes
Low Methoxy Pectin CP Kelco LM-5CS Pectin used to make pectin/collagen blends
Penicillin-streptomycin Merck P4333-100ML Used to inhibit bacterial growth
PureCol EZ Gel solution Merck 5074 Collagen solution used to make alginate/collagen blends
Sodium Alginate Merck 9005-38-3 Alginate powder used to make alginate/collagen blends 
TrypLE select  Fisher Scientific 12563011 cell dissociation enzyme
T75 Flasks StarLab CC7682-4175 Used for culturing cells
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1880 (2001).
  2. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  3. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  4. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  5. Iordachescu, A., et al. An in vitro model for the development of mature bone containing an osteocyte network. Advanced Biosystems. 2 (2), 1700156 (2018).
  6. Zhang, C., et al. Hydrogel cryopreservation system: an effective method for cell storage. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3330 (2018).
  7. McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
  8. Cheng, W., Zhang, J., Liu, J., Yu, Z. Granular hydrogels for 3D bioprinting applications. View. 1 (3), 20200060 (2020).
  9. Lieben, L. The future of 3D printing of human tissues is taking shape. Nature Reviews Rheumatology. 12 (4), 191 (2016).
  10. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).
  11. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
  12. Zarrintaj, P., et al. Agarose-based biomaterials for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 187, 66-84 (2018).
  13. te Nijenhuis, K. . Thermoreversible Networks: Viscoelastic Properties and Structure of Gels. , 194-202 (1997).
  14. Norton, I. T., Jarvis, D. A., Foster, T. J. A molecular model for the formation and properties of fluid gels. International Journal of Biological Macromolecules. 26 (4), 255-261 (1999).
  15. Fernández Farrés, I., Moakes, R. J. A., Norton, I. T. Designing biopolymer fluid gels: A microstructural approach. Food Hydrocolloids. 42, 362-372 (2014).
  16. Cooke, M. E., et al. Structuring of hydrogels across multiple length scales for biomedical applications. Advanced Materials. 30 (14), 1705013 (2018).
  17. Foster, N. C., Allen, P., El Haj, A. J., Grover, L. M., Moakes, R. J. A. Tailoring therapeutic responses via engineering microenvironments with a novel synthetic fluid gel. Advanced Healthcare Materials. 10 (16), 2100622 (2021).
  18. Ellis, A. L., Norton, A. B., Mills, T. B., Norton, I. T. Stabilisation of foams by agar gel particles. Food Hydrocolloids. 73, 222-228 (2017).
  19. Ghebremedhin, M., Seiffert, S., Vilgis, T. A. Physics of agarose fluid gels: Rheological properties and microstructure. Current Research in Food Science. 4, 436-448 (2021).
  20. Garrec, D. A., Norton, I. T. Understanding fluid gel formation and properties. Journal of Food Engineering. 112 (3), 175-182 (2012).
  21. Garrec, D. A., Guthrie, B., Norton, I. T. Kappa carrageenan fluid gel material properties. Part 1: Rheology. Food Hydrocolloids. 33 (1), 151-159 (2013).
  22. Adams, S., Frith, W. J., Stokes, J. R. Influence of particle modulus on the rheological properties of agar microgel suspensions. Journal of Rheology. 48 (6), 1195-1213 (2004).
  23. Senior, J. J., Cooke, M. E., Grover, L. M., Smith, A. M. Fabrication of complex hydrogel structures using suspended layer additive manufacturing (SLAM). Advanced Functional Materials. 29 (49), 1904845 (2019).
  24. Moakes, R. J. A., et al. A suspended layer additive manufacturing approach to the bioprinting of tri-layered skin equivalents. APL Bioengineering. 5 (4), 046103 (2021).
  25. Moxon, S. R., et al. Suspended manufacture of biological structures. Advanced Materials. 29 (13), 1605594 (2017).
  26. Noor, N., et al. 3D Printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
  27. Compaan, A. M., Song, K., Huang, Y. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (6), 5714-5726 (2019).
  28. Moxon, S. R., et al. Blended alginate/collagen hydrogels promote neurogenesis and neuronal maturation. Materials Science and Engineering: C. 104, 109904 (2019).
  29. Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
  30. Chimene, D., Lennox, K. K., Kaunas, R. R., Gaharwar, A. K. Advanced bioinks for 3D printing: a materials science perspective. Annals of Biomedical Engineering. 44 (6), 2090-2102 (2016).
  31. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  32. Rutz, A. L., Lewis, P. L., Shah, R. N. Toward next-generation bioinks: Tuning material properties pre- and post-printing to optimize cell viability. MRS Bulletin. 42 (8), 563-570 (2017).
  33. Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomedical Materials. 10 (3), 034002 (2015).
  34. Zhou, K., Sun, Y., Yang, J., Mao, H., Gu, Z. Hydrogels for 3D embedded bioprinting: a focused review on bioinks and support baths. Journal of Materials Chemistry B. 10 (12), 1897-1907 (2022).
  35. Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  36. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-Sabah, A., Whitaker, I. S. Printability’ of candidate biomaterials for extrusion based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700264 (2017).
  37. Hinton, T. J., Lee, A., Feinberg, A. W. 3D bioprinting from the micrometer to millimeter length scales: Size does matter. Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 31-37 (2017).
  38. Seoane-Viaño, I., Trenfield, S. J., Basit, A. W., Goyanes, A. Translating 3D printed pharmaceuticals: From hype to real-world clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 553-575 (2021).
  39. Jovic, T. H., Combellack, E. J., Jessop, Z. M., Whitaker, I. S. 3D bioprinting and the future of surgery. Frontiers in Surgery. 7, 609836 (2020).

Tags

Agarose Fluid GelsShear Processing3D BioprintingBioinksSuspending MediumViscometryRheologyOscillatory TestingLinear Viscoelastic Region

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Senior, J. J., Moakes, R. J. A., Cooke, M. E., Moxon, S. R., Smith, A. M., Grover, L. M. Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (195), e64458, doi:10.3791/64458 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image