Eine auf Durchflusszytometrie basierende Hochdurchsatztechnik für das Screening von Integrin-hemmenden Medikamenten

Viele entzündliche Erkrankungen sind durch die Infiltration von Neutrophilen an der Schwellungs- oder Verletzungsstelle gekennzeichnet¹. Um in diese Gewebe einzudringen, müssen die Neutrophilen die Rekrutierungskaskade der Neutrophilen durchlaufen, die einen Arrest im Endothel, eine Extravasation über die Gefäßwand und eine Rekrutierung in das Gewebe beinhaltet². Zirkulierende Neutrophile benötigen eine β2-Integrin-Aktivierung, um diese Kaskade zu vervollständigen, insbesondere für die Arrestphase. Daher können Integrin-hemmende Medikamente, die die Adhäsion, Extravasation und Rekrutierung von Neutrophilen reduzieren, entzündliche Erkrankungen wirksam behandeln ^3,4.

β2-Integrine wurden schon früher für entzündliche Erkrankungen ins Visier genommen. Efalizumab, ein monoklonaler Antikörper, der direkt gegen Integrin αLβ2 gerichtet ist, wurde zur Behandlung von Psoriasis⁵ entwickelt. Efalizumab wurde jedoch aufgrund seiner tödlichen Nebenwirkung – progressiver multifokaler Leukenzephalopathie infolge einer Reaktivierung des JC-Virus – zurückgezogen ^6,7. Neue entzündungshemmende Integrin-basierte Therapien sollten die Aufrechterhaltung der antiinfektiösen Funktionen von Leukozyten berücksichtigen, um Nebenwirkungen zu minimieren. Die Nebenwirkungen von Efalizumab könnten auf die verlängerte Zirkulation monoklonaler Antikörper im Blutkreislauf zurückzuführen sein, die langfristig die Immunfunktionen hemmen könnten⁸. Eine aktuelle Studie zeigt, dass Efalizumab die αLβ2-Vernetzung und die unerwünschte Internalisierung von α4-Integrinen vermittelt, was eine alternative Erklärung für die Nebenwirkungen liefert⁹. Daher könnten kurzlebige, niedermolekulare Antagonisten dieses Problem vermeiden.

Eine Hochdurchsatzmethode zum Screening von niedermolekularen β2-Integrin-Antagonisten unter Verwendung humaner Neutrophiler wird hier vorgestellt. Die β2-Integrinaktivierung erfordert Konformationsänderungen der Integrin-Ektodomäne, um Zugang zu ihrem Liganden zu erhalten und ihre Bindungsaffinität zu diesem zu erhöhen. Im kanonischen Switchblade-Modell dehnt sich die gebogene geschlossene Integrin-Ektodomäne zunächst zu einer extended-closed Konformation aus und öffnet dann ihr Kopfstück zu einer vollständig aktivierten extended-open Konformation^10,11,12,13. Es gibt auch einen alternativen Weg, der vom gebogen-geschlossenen zum gebogen-offenen und ausgestreckt-offenen Weg führt, schließlich 14,15,16,17,18,19. Der konformationsspezifische Antikörper mAb24 bindet an ein Epitop in der humanen β2-I-ähnlichen Domäne, wenn das Kopfstück der Ektodomäne geöffnet ist^20,21,22,23.

Hier wird mit mAb24-APC bestimmt, ob die β2-Integrine aktiviert sind. Zur Aktivierung von Neutrophilen und Integrinen wird in diesem Protokoll N-Formylmethionyl-Leucylphenylalanin (fMLP), ein aus Bakterien gewonnenes kurzes chemotaktisches Peptid, das neutrophile β2-Integrine²⁴ aktivieren kann, als Stimulus verwendet. Wenn fMLP an das Fpr1 auf Neutrophilen bindet, werden nachgeschaltete Signalkaskaden aktiviert, an denen G-Proteine, Phospholipase Cβ und Phosphoinositid-3-Kinase-γ beteiligt sind. Diese Signalereignisse führen letztendlich zu einer Integrinaktivierung über den Inside-Out-Signalweg^18,25. Neben niedermolekularen Antagonisten, die direkt an β2-Integrine binden und Konformationsänderungen der Integrinaktivierung^{verhindern 26}, würden mit dieser Methode auch Verbindungen nachgewiesen, die Komponenten des β2-Integrin-Inside-Out-Aktivierungssignalwegs hemmen können. Automatisierte Durchflusszytometer ermöglichen ein Hochdurchsatz-Screening. Die Identifizierung neuer Antagonisten kann nicht nur unser Verständnis der Integrin-Physiologie vertiefen, sondern auch translationale Einblicke in die Integrin-basierte Anti-Entzündungstherapie liefern.