JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Een op flowcytometrie gebaseerde high-throughput techniek voor het screenen van integrineremmende geneesmiddelen

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/64401
, , , ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Center for Molecular Discovery,University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center,University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology,University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center,University of New Mexico

Summary

Dit protocol beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde, high-throughput screeningsmethode om geneesmiddelen met kleine moleculen te identificeren die de activering van β2-integrine op menselijke neutrofielen remmen.

Abstract

Dit protocol heeft tot doel een methode vast te stellen voor het identificeren van kleine moleculaire antagonisten van β2-integrine-activering, met behulp van conformationele-verandering-rapporterende antilichamen en high-throughput flowcytometrie. De methode kan ook dienen als leidraad voor andere op antilichamen gebaseerde high-throughput screeningsmethoden. β2-integrinen zijn leukocytenspecifieke adhesiemoleculen die cruciaal zijn in immuunresponsen. Neutrofielen vertrouwen op integrine-activering om de bloedbaan te verlaten, niet alleen om infecties te bestrijden, maar ook om betrokken te zijn bij meerdere ontstekingsziekten. Het beheersen van β2-integrine-activering biedt een haalbare benadering voor de behandeling van neutrofielen-geassocieerde ontstekingsziekten. In dit protocol wordt een monoklonaal antilichaam, mAb24, dat specifiek bindt aan het hoofddeksel met hoge affiniteit van β2-integrinen, gebruikt om de activering van β2-integrine op geïsoleerde primaire menselijke neutrofielen te kwantificeren. N-formylmethionyl-leucyl-fenylalanine (fMLP) wordt gebruikt als stimulus om neutrofiele β2-integrinen te activeren. In deze studie werd een flowcytometer met hoge doorvoer gebruikt die in staat is om automatisch plaatmonsters met 384 putjes uit te voeren. De effecten van 320 chemicaliën op de remming van β2-integrine worden binnen 3 uur beoordeeld. Moleculen die zich rechtstreeks richten op β2-integrinen of doelmoleculen in de G-proteïne-gekoppelde receptor-geïnitieerde integrine inside-out activeringssignaleringsroute kunnen via deze benadering worden geïdentificeerd.

Introduction

Veel ontstekingsziekten worden gekenmerkt door de infiltratie van neutrofielen op de plaats van zwelling of verwonding1. Om deze weefsels te infiltreren, moeten neutrofielen de rekruteringscascade van neutrofielen voltooien, waarbij het endotheel wordt gestopt, extravasatie over de vaatwand en rekrutering in het weefsel2. Circulerende neutrofielen hebben β2-integrineactivering nodig om deze cascade te voltooien, vooral voor de stopfase. Integrine-remmende geneesmiddelen die de adhesie, extravasatie en rekrutering van neutrofielen verminderen, kunnen dus ontstekingsziekten effectiefbehandelen3,4.

β2-integrinen zijn eerder het doelwit geweest van ontstekingsziekten. Efalizumab, een monoklonaal antilichaam dat zich rechtstreeks richt op integrine αLβ2, werd ontwikkeld voor de behandeling van psoriasis5. Efalizumab werd echter gestaakt vanwege de dodelijke bijwerking – progressieve multifocale leuko-encefalopathie als gevolg van reactivering van het JC-virus 6,7. Nieuwe ontstekingsremmende therapieën op basis van integrine moeten overwegen om de anti-infectiefuncties van leukocyten te handhaven om bijwerkingen te minimaliseren. De bijwerkingen van efalizumab kunnen te wijten zijn aan de langdurige circulatie van monoklonale antilichamen in de bloedbaan, die op de lange termijn immuunfuncties kunnen remmen8. Een recente studie toont aan dat efalizumab αLβ2-crosslinking en de ongewenste internalisatie van α4-integrinen bemiddelt, wat een alternatieve verklaring biedt voor de bijwerkingen9. Kortstondige antagonisten met kleine moleculen kunnen dit probleem dus vermijden.

Een high-throughput methode om kleine moleculen β2 integrine antagonisten te screenen met behulp van menselijke neutrofielen wordt hier gepresenteerd. Β2-integrineactivering vereist conformatieveranderingen van het integrine-ectodomein om toegang te krijgen tot de bindingsaffiniteit met zijn ligand en deze te vergroten. In het canonieke switchblade-model strekt het bent-gesloten integrine-ectodomein zich eerst uit tot een verlengd-gesloten conformatie en opent vervolgens zijn kopstuk tot een volledig geactiveerde extended-open conformatie10,11,12,13. Er is ook een alternatief pad dat begint van de gebogen-gesloten naar gebogen-open en uitgebreid-open, uiteindelijk 14,15,16,17,18,19. Het conformatiespecifieke antilichaam mAb24 bindt zich aan een epitoop in het menselijke β2-I-achtige domein wanneer het zendspoel van het ectodomein open is 20,21,22,23.

Hier wordt mAb24-APC gebruikt om te bepalen of de β2-integrinen geactiveerd zijn. Om neutrofielen en integrine te activeren, wordt N-formylmethionyl-leucyl-fenylalanine (fMLP), een bacterieel afgeleid kort chemotactisch peptide dat neutrofiele β2-integrinen24 kan activeren, gebruikt als stimulus in dit protocol. Wanneer fMLP bindt aan het Fpr1 op neutrofielen, worden stroomafwaartse signaalcascades met G-eiwitten, fosfolipase Cβ en fosfoinositide-3-kinase γ geactiveerd. Deze signaleringsgebeurtenissen resulteren uiteindelijk in integrine-activering via de inside-out signaleringsroute18,25. Naast kleine molecuulantagonisten die direct binden aan β2-integrinen en conformatieveranderingen van integrine-activatievoorkomen 26, zouden met deze methode ook verbindingen worden gedetecteerd die componenten in de β2-integrine inside-out activeringssignaleringsroute kunnen remmen. Geautomatiseerde flowcytometers maken screening met hoge doorvoer mogelijk. Het identificeren van nieuwe antagonisten kan niet alleen ons begrip van integrinefysiologie verdiepen, maar ook translationeel inzicht verschaffen in op integrine gebaseerde anti-inflammatoire therapie.

Protocol

Gehepariniseerde volbloedmonsters werden verkregen van geanonimiseerde gezonde menselijke donoren na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming, zoals goedgekeurd door de Institutional Review Board van UConn Health, volgens de principes van de Verklaring van Helsinki. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle donoren. De inclusie-/exclusiecriteria voor dit onderzoek zijn zorgvuldig ontwikkeld om de geschiktheid van deelnemers te waarborgen en mogelijke risico’s te minimaliseren. In aanmerking komende deelneme…

Representative Results

Gegevens van een representatieve plaatscreening met 384 putjes (figuur 4) toonden aan dat negatieve controles een MFI van mAb24-APC van 3236 ± 110 hadden, terwijl positieve controles een MFI van mAb24-APC van 7588 ± 858 hadden. De Z’-factor voor deze plaat is ongeveer 0,33, wat binnen een acceptabel bereik31 ligt. Z’ vereist echter verdere validatie in secundaire assays. Om de gegevens te normaliseren, werden alle waarden geschaald om een…

Discussion

De initiatie en beëindiging van neutrofielenstimulatie en kleuring worden bepaald door de toevoeging van neutrofielen en het fixatief PFA. Daarom is het van cruciaal belang om te zorgen voor hetzelfde tijdsinterval tussen het pipetteren van neutrofielen of PFA in elke kolom. Dit zorgt ervoor dat de stimulatie- en kleuringstijd van neutrofielen uit elk putje consistent blijft. Vanwege de korte levensduur van neutrofielen moet het hele experiment, van het afnemen van bloed bij donoren tot het voltooien van flowcytometrie,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Dr. Evan Jellison en mevrouw Li Zhu in de flowcytometriekern bij UConn Health voor hun hulp bij flowcytometrie, Dr. Lynn Puddington van de afdeling Immunologie van UConn Health voor haar steun aan de instrumenten, mevrouw Slawa Gajewska en Dr. Paul Appleton in de klinische onderzoekskern bij UConn Health voor hun hulp bij het verkrijgen van bloedmonsters. We danken Dr. Christopher “Kit” Bonin en Dr. Geneva Hargis van de UConn School of Medicine voor hun hulp bij het wetenschappelijk schrijven en redigeren van dit manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), VS, een Career Development Award van de American Heart Association (18CDA34110426) en een startfonds van UConn Health. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.

Materials

16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
  5. Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
  6. Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
  7. Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
  8. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
  9. Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
  10. Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
  11. Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
  12. Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
  14. Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
  16. Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
  17. Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
  18. Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
  19. Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
  20. Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
  21. Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
  22. Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
  23. Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
  24. Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
  25. Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
  26. Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
  27. Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
  28. Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
  29. Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
  30. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  32. Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
  33. Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
  34. Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
  35. Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
  36. Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
  37. Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
  38. Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
  39. Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  40. Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
  41. Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
  42. Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
  43. Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
  44. Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
  45. Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
  46. Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
  47. Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
  48. Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
  49. Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
  50. van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
  51. Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
  52. Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
  53. Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
  54. Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
  55. Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
  56. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).

Tags

Flow CytometryHigh-throughput ScreeningIntegrin InhibitorBeta-2 IntegrinNeutrophilAnti-inflammatoryConformational Change AntibodyFMLPGPCR

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image