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Abstract
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Immunology and Infection

Technique à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour le criblage de médicaments inhibiteurs de l’intégrine

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/64401
, , , ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Center for Molecular Discovery,University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center,University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology,University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center,University of New Mexico

Summary

Ce protocole décrit une méthode de criblage à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour identifier les médicaments à petites molécules qui inhibent l’activation de l’intégrine β2 sur les neutrophiles humains.

Abstract

Ce protocole vise à établir une méthode d’identification des petits antagonistes moléculaires de l’activation de l’intégrine β2, en utilisant des anticorps rapporteurs de changement conformationnel et une cytométrie en flux à haut débit. La méthode peut également servir de guide pour d’autres méthodes de criblage à haut débit à base d’anticorps. Les intégrines β2 sont des molécules d’adhésion spécifiques aux leucocytes qui sont cruciales dans les réponses immunitaires. Les neutrophiles dépendent de l’activation de l’intégrine pour sortir de la circulation sanguine, non seulement pour combattre les infections, mais aussi pour être impliqués dans de multiples maladies inflammatoires. Le contrôle de l’activation de l’intégrine β2 présente une approche viable pour le traitement des maladies inflammatoires associées aux neutrophiles. Dans ce protocole, un anticorps monoclonal, mAb24, qui se lie spécifiquement à la coiffe de haute affinité des intégrines β2, est utilisé pour quantifier l’activation de l’intégrine β2 sur des neutrophiles humains primaires isolés. La N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP) est utilisée comme stimulus pour activer les intégrines β2 des neutrophiles. Un cytomètre en flux à haut débit capable d’analyser automatiquement des échantillons de plaques à 384 puits a été utilisé dans cette étude. Les effets de 320 produits chimiques sur l’inhibition de l’intégrine β2 sont évalués dans les 3 heures. Les molécules qui ciblent directement les intégrines β2 ou les molécules cibles dans la voie de signalisation d’activation de l’intégrine initiée par le récepteur couplé aux protéines G peuvent être identifiées grâce à cette approche.

Introduction

De nombreuses maladies inflammatoires sont caractérisées par l’infiltration de neutrophiles sur le site d’un gonflement ou d’une blessure1. Pour infiltrer ces tissus, les neutrophiles doivent compléter la cascade de recrutement des neutrophiles, qui implique l’arrêt de l’endothélium, l’extravasation à travers la paroi du vaisseau et le recrutement dans le tissu2. Les neutrophiles circulants ont besoin de l’activation de l’intégrine β2 pour compléter cette cascade, en particulier pour la phase d’arrêt. Ainsi, les médicaments inhibiteurs de l’intégrine qui réduisent l’adhésion, l’extravasation et le recrutement des neutrophiles peuvent traiter efficacement les maladies inflammatoires 3,4.

Les intégrines β2 ont déjà été ciblées pour des maladies inflammatoires. L’efalizumab, un anticorps monoclonal ciblant directement l’intégrine αLβ2, a été développé pour traiter le psoriasis5. Cependant, l’efalizumab a été retiré en raison de son effet secondaire mortel – une leucoencéphalopathie multifocale progressive résultant de la réactivation du virus JC 6,7. Les nouveaux traitements anti-inflammatoires à base d’intégrine devraient envisager de maintenir les fonctions anti-infectieuses des leucocytes afin de minimiser les effets secondaires. Les effets secondaires de l’efalizumab pourraient être dus à la circulation prolongée d’anticorps monoclonaux dans le sang, ce qui pourrait inhiber les fonctions immunitaires à long terme8. Une étude récente montre que l’efalizumab intervient dans la réticulation de l’αLβ2 et l’internalisation indésirable des intégrines α4, fournissant une explication alternative des effets secondaires9. Ainsi, les antagonistes à petites molécules à courte durée de vie pourraient éviter ce problème.

Une méthode à haut débit pour cribler les antagonistes de l’intégrine β2 de petites molécules à l’aide de neutrophiles humains est présentée ici. L’activation de l’intégrine β2 nécessite des changements conformationnels de l’ectodomaine de l’intégrine pour accéder à son ligand et augmenter son affinité de liaison avec celui-ci. Dans le modèle canonique à cran d’arrêt, l’ectodomaine de l’intégrine courbée-fermée s’étend d’abord jusqu’à une conformation étendue-fermée, puis ouvre sa coiffe à une conformation ouverte-étendue entièrement activée10,11,12,13. Il existe également une voie alternative qui part de la fermeture courbée à l’ouverture courbée et à l’ouverture étendue, éventuellement 14,15,16,17,18,19. L’anticorps spécifique de la conformation mAb24 se lie à un épitope dans le domaine humain de type β2-I lorsque la coiffe de l’ectodomaine est ouverte20,21,22,23.

Ici, mAb24-APC est utilisé pour déterminer si les intégrines β2 sont activées. Pour activer les neutrophiles et l’intégrine, la N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP), un peptide chimiotactique court d’origine bactérienne capable d’activer les intégrines β2 des neutrophiles24, est utilisée comme stimulus dans ce protocole. Lorsque fMLP se lie à Fpr1 sur les neutrophiles, des cascades de signalisation en aval impliquant des protéines G, la phospholipase Cβ et la phosphoinositide 3-kinase γ sont activées. Ces événements de signalisation aboutissent finalement à l’activation de l’intégrine via la voie de signalisation de l’intérieur vers l’extérieur18,25. Outre les antagonistes de petites molécules qui se lient directement aux intégrines β2 et empêchent les changements conformationnels de l’activation de l’intégrine26, des composés capables d’inhiber les composants de la voie de signalisation d’activation de l’intégrine β2 de l’intérieur vers l’extérieur seraient également détectés avec cette méthode. Les cytomètres en flux automatisés permettent un criblage à haut débit. L’identification de nouveaux antagonistes peut non seulement approfondir notre compréhension de la physiologie de l’intégrine, mais aussi fournir des informations translationnelles sur le traitement anti-inflammatoire à base d’intégrine.

Protocol

Des échantillons de sang total hépariné ont été obtenus auprès de donneurs humains sains anonymisés après avoir obtenu un consentement éclairé, tel qu’approuvé par l’Institutional Review Board de UConn Health, conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki. Le consentement éclairé de tous les donneurs a été obtenu. Les critères d’inclusion et d’exclusion de cette étude ont été soigneusement élaborés afin de s’assurer de la pertinence des participants et de minimiser les risques…

Representative Results

Les données d’un criblage représentatif de plaques à 384 puits (Figure 4) ont révélé que les témoins négatifs avaient une MFI de mAb24-APC de 3236 ± 110, tandis que les témoins positifs avaient une MFI de mAb24-APC de 7588 ± 858. Le facteur Z’ de cette plaque est d’environ 0,33, ce qui se situe dans une plage acceptablede 31. Cependant, Z’ nécessite une validation supplémentaire dans les tests secondaires. Pour normaliser l…

Discussion

L’initiation et l’arrêt de la stimulation et de la coloration des neutrophiles sont déterminés par l’ajout de neutrophiles et du PFA fixateur. Par conséquent, il est essentiel d’assurer le même intervalle de temps entre le pipetage des neutrophiles ou de l’APF dans chaque colonne. Cela garantit que le temps de stimulation et de coloration des neutrophiles de chaque puits reste constant. En raison de la courte durée de vie des neutrophiles, l’ensemble de l’expérience, de la collecte de sang des donneu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Evan Jellison et Mme Li Zhu du centre de cytométrie en flux de UConn Health pour leur aide en matière de cytométrie en flux, le Dr Lynn Puddington du département d’immunologie de UConn Health pour son soutien aux instruments, Mme Slawa Gajewska et le Dr Paul Appleton du noyau de recherche clinique de UConn Health pour leur aide dans l’obtention d’échantillons de sang. Nous remercions le Dr Christopher « Kit » Bonin et la Dre Geneva Hargis de l’École de médecine de l’UConn pour leur aide dans la rédaction scientifique et l’édition de ce manuscrit. Cette recherche a été financée par des subventions des National Institutes of Health, du National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), de l’Institut national des sciences médicales générales (P20GM121176), aux États-Unis, d’un prix de développement de carrière de l’American Heart Association (18CDA34110426) et d’un fonds de démarrage de UConn Health. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

Materials

16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument
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Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).
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