JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/64401
, , , ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Center for Molecular Discovery,University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center,University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology,University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center,University of New Mexico

Summary

Bu protokol, insan nötrofilleri üzerinde β2 integrin aktivasyonunu inhibe eden küçük moleküllü ilaçları tanımlamak için akış sitometrisi tabanlı, yüksek verimli bir tarama yöntemini açıklar.

Abstract

Bu protokol, konformasyonel değişiklik bildiren antikorlar ve yüksek verimli akış sitometrisi kullanarak β2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini tanımlamak için bir yöntem oluşturmayı amaçlamaktadır. Yöntem ayrıca diğer antikor bazlı yüksek verimli tarama yöntemleri için bir kılavuz görevi görebilir. β2 integrinler, bağışıklık tepkilerinde çok önemli olan lökositlere özgü adezyon molekülleridir. Nötrofiller, sadece enfeksiyonlarla savaşmak için değil, aynı zamanda çoklu enflamatuar hastalıklara karışmak için kan dolaşımından çıkmak için integrin aktivasyonuna güvenirler. β2 integrin aktivasyonunun kontrol edilmesi, nötrofil ile ilişkili enflamatuar hastalıkların tedavisi için uygun bir yaklaşım sunar. Bu protokolde, izole edilmiş primer insan nötrofilleri üzerinde β2 integrin aktivasyonunu ölçmek için β2 integrinlerinin yüksek afiniteli başlığına spesifik olarak bağlanan bir monoklonal antikor olan mAb24 kullanılır. N-formilmetiyonil-lösil-fenilalanin (fMLP), nötrofil β2 integrinlerini aktive etmek için bir uyarıcı olarak kullanılır. Bu çalışmada 384 oyuklu plaka numunelerini otomatik olarak çalıştırabilen yüksek verimli bir akış sitometresi kullanılmıştır. 320 kimyasalın β2 integrin inhibisyonu üzerindeki etkileri 3 saat içinde değerlendirilir. G proteinine bağlı reseptör tarafından başlatılan integrin içten dışa aktivasyon sinyal yolundaki β2 integrinlerini veya hedef molekülleri doğrudan hedefleyen moleküller bu yaklaşımla tanımlanabilir.

Introduction

Birçok enflamatuar hastalık, nötrofillerin şişme veya yaralanma bölgesine infiltrasyonu ile karakterizedir1. Bu dokulara sızmak için nötrofiller, endotelin tutuklanmasını, damar duvarı boyunca ekstravazasyonu ve doku2’ye alımını içeren nötrofil alım kaskadını tamamlamalıdır. Dolaşımdaki nötrofiller, özellikle tutuklama aşaması için bu kaskadı tamamlamak için β2 integrin aktivasyonuna ihtiyaç duyar. Bu nedenle, nötrofil yapışmasını, ekstravazasyonu ve işe alımını azaltan integrin inhibe edici ilaçlar, enflamatuar hastalıkları etkili bir şekilde tedavi edebilir 3,4.

β2 integrinleri daha önce inflamatuar hastalıklar için hedeflenmiştir. Doğrudan integrin αLβ2’yi hedef alan bir monoklonal antikor olan Efalizumab, sedef hastalığı5’i tedavi etmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, efalizumab ölümcül yan etkisi nedeniyle geri çekildi – JC virüsü reaktivasyonundan kaynaklanan ilerleyici multifokal lökoensefalopati 6,7. Yeni anti-inflamatuar integrin bazlı tedaviler, yan etkileri en aza indirmek için lökositlerin anti-enfeksiyon fonksiyonlarını sürdürmeyi düşünmelidir. Efalizumabın yan etkileri, kan dolaşımındaki monoklonal antikorların uzun süreli dolaşımına bağlı olabilir ve bu da uzun vadede bağışıklık fonksiyonlarını inhibe edebilir8. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, efalizumabın αLβ2 çapraz bağlanmasına ve α4 integrinlerinin istenmeyen içselleştirilmesine aracılık ettiğini ve yan etkiler için alternatif bir açıklama sağladığını göstermektedir9. Bu nedenle, kısa ömürlü, küçük moleküllü antagonistler bu sorunu önleyebilir.

İnsan nötrofillerini kullanarak küçük moleküllü β2 integrin antagonistlerini taramak için yüksek verimli bir yöntem burada sunulmaktadır. β2 integrin aktivasyonu, ligandına erişmek ve bağlanma afinitesini artırmak için integrin ektodomaininin konformasyonel değişikliklerini gerektirir. Kanonik sustalı modelde, bükülmüş-kapalı integrin ektodomain önce uzatılmış-kapalı bir konformasyona uzanır ve daha sonra başlığını tamamen etkinleştirilmiş uzatılmış-açık konformasyona10,11,12,13 açar. Bükülmüş-kapalıdan bükülmüş-açık ve uzatılmış-açık, sonunda 14,15,16,17,18,19’a kadar uzanan alternatif bir yol da vardır. Konformasyona özgü antikor mAb24, ektodomainin başlığı açık olduğunda insan β2-I benzeri alandaki bir epitopa bağlanır20,21,22,23.

Burada, β24 integrinlerinin aktive edilip edilmediğini belirlemek için mAb2-APC kullanılır. Nötrofilleri ve integrini aktive etmek için, nötrofil β2 integrinlerini24 aktive edebilen bakteri kaynaklı kısa bir kemotaktik peptit olan N-formilmetiyonil-lösil-fenilalanin (fMLP) bu protokolde uyarıcı olarak kullanılır. fMLP, nötrofiller üzerindeki Fpr1’e bağlandığında, G-proteinleri, fosfolipaz Cβ ve fosfoinositid 3-kinaz γ içeren aşağı akış sinyal kaskadları aktive edilir. Bu sinyal olayları nihayetinde içten dışa sinyal yolu18,25 aracılığıyla integrin aktivasyonu ile sonuçlanır. β2 integrinlerine doğrudan bağlanan ve integrin aktivasyonu26’nın konformasyonel değişikliklerini önleyen küçük molekül antagonistlerinin yanı sıra, β2 integrin içten dışa aktivasyon sinyal yolundaki bileşenleri inhibe edebilen bileşikler de bu yöntemle tespit edilecektir. Otomatik akış sitometreleri, yüksek verimli tarama sağlar. Yeni antagonistleri tanımlamak, yalnızca integrin fizyolojisi anlayışımızı derinleştirmekle kalmaz, aynı zamanda integrin bazlı anti-inflamasyon tedavisine translasyonel içgörü sağlayabilir.

Protocol

Heparinize tam kan örnekleri, Helsinki Bildirgesi’nin ilkelerine uygun olarak, UConn Health Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandığı üzere, bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra, kimliksizleştirilmiş sağlıklı insan donörlerden elde edildi. Tüm donörlerden bilgilendirilmiş onam alındı. Bu çalışma için dahil etme/hariç tutma kriterleri, katılımcıların uygunluğunu sağlamak ve potansiyel riskleri en aza indirmek için dikkatlice geliştirilmiştir. Uygun katılımcılar 18 ila 65 yaşl…

Representative Results

Temsili bir 384 oyuklu plaka taramasından elde edilen veriler (Şekil 4), negatif kontrollerin MFI’sinin 3236 ± 110 mAb24-APC’ye sahip olduğunu, pozitif kontrollerin ise 7588 ± 858’lik bir mAb24-APC MFI’sine sahip olduğunu ortaya koydu. Bu plaka için Z’ faktörü yaklaşık 0.33’tür ve bu kabul edilebilir biraralık 31’dir. Bununla birlikte, Z’ ikincil tahlillerde daha fazla doğrulama gerektirir. Verileri normalleştirmek için, tü…

Discussion

Nötrofil stimülasyonu ve boyamanın başlatılması ve sonlandırılması, nötrofillerin ve fiksatif PFA’nın eklenmesiyle belirlenir. Bu nedenle, nötrofillerin veya PFA’nın her sütuna pipetlenmesi arasında aynı zaman aralığının sağlanması çok önemlidir. Bu, her bir kuyucuktan nötrofillerin uyarılma ve boyama süresinin tutarlı kalmasını sağlar. Nötrofillerin kısa ömrü nedeniyle, donörlerden kan toplanmasından akış sitometrisinin tamamlanmasına kadar tüm deney aynı gün yapılmalıdır. N…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

UConn Health’teki akış sitometrisi çekirdeğinden Dr. Evan Jellison ve Bayan Li Zhu’ya akış sitometrisi konusundaki yardımları için, UConn Health İmmünoloji Bölümü’nden Dr. Lynn Puddington’a cihazlara verdikleri destek için, UConn Health’teki klinik araştırma merkezinden Bayan Slawa Gajewska ve Dr. Paul Appleton’a kan örnekleri almadaki yardımları için teşekkür ederiz. UConn Tıp Fakültesi’nden Dr. Christopher “Kit” Bonin ve Dr. Geneva Hargis’e bu makalenin bilimsel yazımı ve düzenlenmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (R01HL145454), Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (P20GM121176), ABD, Amerikan Kalp Derneği’nden Kariyer Geliştirme Ödülü (18CDA34110426) ve UConn Health’ten bir başlangıç fonu. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Materials

16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
  5. Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
  6. Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
  7. Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
  8. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
  9. Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
  10. Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
  11. Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
  12. Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
  14. Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
  16. Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
  17. Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
  18. Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
  19. Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
  20. Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
  21. Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
  22. Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
  23. Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
  24. Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
  25. Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
  26. Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
  27. Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
  28. Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
  29. Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
  30. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  32. Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
  33. Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
  34. Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
  35. Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
  36. Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
  37. Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
  38. Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
  39. Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  40. Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
  41. Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
  42. Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
  43. Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
  44. Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
  45. Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
  46. Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
  47. Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
  48. Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
  49. Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
  50. van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
  51. Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
  52. Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
  53. Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
  54. Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
  55. Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
  56. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).

Tags

Flow CytometryHigh-throughput ScreeningIntegrin InhibitorBeta-2 IntegrinNeutrophilAnti-inflammatoryConformational Change AntibodyFMLPGPCR

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image