تقنية عالية الإنتاجية قائمة على قياس التدفق الخلوي لفحص الأدوية المثبطة للإنتغرين
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة فحص عالية الإنتاجية قائمة على قياس التدفق الخلوي لتحديد الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة التي تمنع تنشيط β2 integrin على العدلات البشرية.
Abstract
يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء طريقة لتحديد المضادات الجزيئية الصغيرة لتنشيط β2 integrin ، باستخدام الأجسام المضادة للإبلاغ عن التغيير المطابق وقياس التدفق الخلوي عالي الإنتاجية. يمكن أن تكون الطريقة أيضا بمثابة دليل لطرق الفحص الأخرى عالية الإنتاجية القائمة على الأجسام المضادة. β2 integrins هي جزيئات التصاق خاصة بالكريات البيض والتي تعتبر حاسمة في الاستجابات المناعية. تعتمد العدلات على تنشيط الإنتغرين للخروج من مجرى الدم ، ليس فقط لمكافحة العدوى ولكن أيضا للمشاركة في أمراض التهابية متعددة. يمثل التحكم في تنشيط β2 integrin نهجا قابلا للتطبيق لعلاج الأمراض الالتهابية المرتبطة بالعدلات. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام جسم مضاد وحيد النسيلة ، mAb24 ، والذي يرتبط على وجه التحديد بغطاء الرأس عالي التقارب ل β2 integrins ، لتحديد تنشيط β2 integrin على العدلات البشرية الأولية المعزولة. يستخدم N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) كحافز لتنشيط العدلات β2 integrins. تم استخدام مقياس خلوي عالي الإنتاجية قادر على تشغيل عينات صفيحة 384 بئرا تلقائيا في هذه الدراسة. يتم تقييم آثار 320 مادة كيميائية على تثبيط β2 integrin في غضون 3 ساعات. يمكن تحديد الجزيئات التي تستهدف مباشرة β2 integrins أو الجزيئات المستهدفة في مسار إشارات التنشيط من الداخل إلى الخارج الذي بدأه مستقبلات البروتين G من الداخل إلى الخارج من خلال هذا النهج.
Introduction
تتميز العديد من الأمراض الالتهابية بتسلل العدلات في موقع التورم أو الإصابة1. للتسلل إلى هذه الأنسجة ، يجب أن تكمل العدلات سلسلة تجنيد العدلات ، والتي تنطوي على الاعتقال إلى البطانة ، والإسراف عبر جدار الوعاء الدموي ، والتجنيد في الأنسجة2. تحتاج العدلات المتداولة إلى تنشيط β2 integrin لإكمال هذا الشلال ، خاصة لمرحلة الاعتقال. وبالتالي ، فإن الأدوية المثبطة للإنتغرين التي تقلل من التصاق العدلات ، والإسراف ، والتوظيف قد تعالج الأمراض الالتهابية بشكل فعال 3,4.
تم استهداف β2 integrins للأمراض الالتهابية من قبل. تم تطوير Efalizumab ، وهو جسم مضاد وحيد النسيلة يستهدف مباشرة integrin αLβ2 ، لعلاج الصدفية5. ومع ذلك ، تم سحب efalizumab بسبب آثاره الجانبية القاتلة – اعتلال بيضاء الدماغ متعدد البؤر التدريجي الناتج عن إعادة تنشيط فيروس JC 6,7. يجب أن تأخذ العلاجات الجديدة القائمة على الإنتيرين المضادة للالتهابات في الاعتبار الحفاظ على الوظائف المضادة للعدوى في كريات الدم البيضاء لتقليل الآثار الجانبية. قد تكون الآثار الجانبية لإفاليزوماب بسبب الدوران المطول للأجسام المضادة وحيدة النسيلة في مجرى الدم ، والتي يمكن أن تمنع وظائف المناعة على المدىالطويل 8. أظهرت دراسة حديثة أن efalizumab يتوسط التشابك αLβ2 والاستيعاب غير المرغوب فيه ل α4 integrins ، مما يوفر تفسيرا بديلا للآثار الجانبية9. وبالتالي ، قد تتجنب مضادات الجزيئات الصغيرة قصيرة العمر هذه المشكلة.
يتم تقديم طريقة عالية الإنتاجية لفحص مضادات الميكروين β2 ذات الجزيئات الصغيرة باستخدام العدلات البشرية هنا. يتطلب تنشيط Β2 Integrin تغييرات توافقية في المجال الخارجي للإنتغرين للوصول إلى وزيادة تقاربه المرتبط برابطته. في نموذج شفرة التبديل المتعارف عليها ، يمتد المجال الخارجي للإنتغرين المغلق المنحني أولا إلى شكل مغلق ممتد ثم يفتح غطاء رأسه إلى تشكيل مفتوح ممتد نشط بالكامل10،11،12،13. هناك أيضا مسار بديل يبدأ من الانحناء المغلق إلى الانحناء المفتوح والممتد المفتوح ، في النهاية14،15،16،17،18،19. يرتبط الجسم المضاد الخاص بالتشكل mAb24 بخاتمة في المجال البشري الشبيه ب β2-I عندما يكون غطاء رأس المجال الخارجي مفتوحا20،21،22،23.
هنا ، يتم استخدام mAb24-APC لتحديد ما إذا كان يتم تنشيط β2 integrins. لتنشيط العدلات والانتغرين ، يتم استخدام N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) ، وهو ببتيد كيميائي قصير مشتق من البكتيريا يمكنه تنشيط العدلات β2 integrins24 ، كحافز في هذا البروتوكول. عندما يرتبط fMLP ب Fpr1 على العدلات ، يتم تنشيط شلالات إشارات المصب التي تتضمن بروتينات G و phospholipase Cβ و phosphoinositide 3-kinase γ. تؤدي أحداث الإشارة هذه في النهاية إلى تنشيط integrin عبر مسار الإشارات من الداخل إلى الخارج18,25. إلى جانب مضادات الجزيئات الصغيرة التي ترتبط مباشرة ب β2 integrins وتمنع التغيرات التوافقية لتنشيط integrin26 ، سيتم أيضا اكتشاف المركبات التي يمكن أن تمنع المكونات في مسار إشارات التنشيط β2 integrin من الداخل إلى الخارج باستخدام هذه الطريقة. تتيح مقاييس التدفق الخلوي الآلية الفحص عالي الإنتاجية. قد لا يؤدي تحديد الخصوم الجدد إلى تعميق فهمنا لفسيولوجيا الأنتغرين فحسب ، بل يوفر أيضا نظرة ثاقبة متعدية للعلاج المضاد للالتهابات القائم على الأنتغرين.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تحديد بدء وإنهاء تحفيز العدلات وتلطيخها عن طريق إضافة العدلات و PFA المثبت. لذلك ، فإن ضمان نفس الفاصل الزمني بين العدلات الماصة أو PFA في كل عمود أمر بالغ الأهمية. هذا يضمن أن وقت التحفيز وتلطيخ العدلات من كل بئر لا يزال ثابتا. نظرا لقصر عمر العدلات ، يجب إجراء التجربة بأكملها ، من جمع الدم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور إيفان جيليسون والسيدة لي تشو في قلب قياس التدفق الخلوي في UConn Health لمساعدتهم في قياس التدفق الخلوي ، والدكتورة لين بودينجتون في قسم المناعة في UConn Health لدعمها للأدوات ، والسيدة Slawa Gajewska والدكتور Paul Appleton في جوهر البحث السريري في UConn Health لمساعدتهم في الحصول على عينات الدم. نحن نقدر الدكتور كريستوفر “كيت” بونين والدكتورة جنيف هارجيس من كلية الطب بجامعة كاليفورنيا لمساعدتهما في الكتابة العلمية وتحرير هذه المخطوطة. تم دعم هذا البحث بمنح من المعاهد الوطنية للصحة ، والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم (R01HL145454) ، والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (P20GM121176) ، الولايات المتحدة الأمريكية ، وجائزة التطوير الوظيفي من جمعية القلب الأمريكية (18CDA34110426) ، وصندوق بدء التشغيل من UConn Health. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.
Materials
| 16-channel pipettes | Thermo | 4661090N | Instrument |
| 384-well plate | Greiner | 784201 | Materials |
| APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 | BioLegend | 363410 | Reagents |
| Bravo Automated Liquid Handling Platform | Agilent | 16050-102 | 384 multi-channel liquid handler |
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | Instrument |
| FlowJo | Becton, Dickinson & Company | NA | Software |
| Human Serum Albumin Solution (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagents |
| Lifitegrast | Thermofisher | 50-208-2121 | Reagents |
| Nexinhib20 | Tocris | 6089 | Reagents |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | F3506 | Reagents |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagents |
| Plate buckets | Eppendorf | UL155 | Accessory |
| Plate shaker | Fisher | 88-861-023 | Instrument |
| PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (previous 1114683) | Reagents |
| Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) | Prestwick Chemical Libraries | Ver19_384 | 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved) |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | Gibco | 11-835-030 | Reagents |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | Rotor |
| ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad Laboratories | Model ZE5 | Instrument |
References
- Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
- Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
- Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
- Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
- Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
- Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
- Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
- Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
- Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
- Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
- Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
- Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
- Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
- Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
- Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
- Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
- Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
- Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
- Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
- Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
- Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
- Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
- Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
- Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
- Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
- Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
- Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
- Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
- Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
- Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
- Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
- Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
- Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
- Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
- Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
- Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
- Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
- Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
- Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
- Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
- Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
- Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
- Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
- Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
- Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
- Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
- Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
- van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
- Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
- Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
- Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
- Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
- Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
- Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).
