Identificación y aislamiento de progenitores eritroides de unidades formadoras de ráfagas y unidades formadoras de colonias a partir de tejido de ratón mediante citometría de flujo

La eritropoyesis puede dividirse en dos fases principales: eritropoyesis precoz y diferenciación terminal eritroide (Figura 1)^1,2,3. En la eritropoyesis temprana, las células madre hematopoyéticas se comprometen con el linaje eritroide y dan lugar a progenitores eritroides tempranos, que se identificaron por primera vez en la década de 1970 en función de su potencial de formación de colonias en medio semisólido 4,5,6,7,8,9 . En términos generales, los progenitores eritroides se dividen en dos categorías: progenitores anteriores que dan lugar a un “estallido” (un gran agregado de grupos de células eritroides más pequeños), llamado “eritroide unitario formador de estallido” o BFU-e ^4,5,6; y su progenie, que forman cada uno un único grupo o colonia de células eritroides pequeñas, denominadas “unidad formadora de colonias eritroides” o UFC-e ^7,8,9. BFU-e y CFU-e aún no expresan genes eritroides terminales y no son morfológicamente reconocibles. Después de una serie de divisiones celulares de auto-renovación o expansión, la UFC-e experimenta un cambio transcripcional en el que se inducen genes eritroides como globinas, pasando así a la diferenciación terminal eritroide (ETD)^1,10. Durante la ETD, los eritroblastos se someten a tres a cinco divisiones celulares madurativas antes de enuclearse para formar reticulocitos, que maduran en glóbulos rojos.

Los eritroblastos durante la diferenciación terminal se clasificaron originalmente en función de su morfología en proeritroblastos, basófilos, policromáticos y ortocromáticos. El advenimiento de la citometría de flujo permitió su clasificación y aislamiento prospectivo basado en el tamaño celular (medido por dispersión directa, FSC) y dos marcadores de superficie celular, CD71 y Ter119^11,12,13 (Figura 1). Este y otros enfoques citométricos de flujo similares 14 han revolucionado la investigación de los aspectos moleculares y celulares de la ETD, permitiendo el análisis específico de la etapa de desarrollo de eritroblastos in vivo e in vitro 10,15,16,17,18,19,20. El enfoque CD71/Ter119 ahora se usa rutinariamente en el análisis de precursores eritroides.

Hasta hace poco, un enfoque citométrico de flujo similar y accesible para el aislamiento prospectivo directo y de alta pureza de CFU-e y BFU-e de tejido de ratón ha eludido a los investigadores. En cambio, los investigadores han utilizado estrategias citométricas de flujo que aíslan solo una fracción de estos progenitores, a menudo en presencia de células no eritroides que se purifican conjuntamente dentro de los mismos subconjuntos citométricos de flujo²¹. En consecuencia, la investigación de BFU-e y CFU-e se limitó a sistemas de diferenciación in vitro que derivan y amplifican BFU-e y CFU-e de progenitores de médula ósea anteriores. Entonces es posible aplicar estrategias citométricas de flujo que distinguan la UFC-e de la BFU-e en estos cultivos enriquecidos con progenitores eritroides^22,23. Un enfoque alternativo hace uso de UFC-e fetal y BFU-e, que están altamente enriquecidas en la fracción Ter119-negativa del hígado fetal de ratón a mediados de la gestación 10,24,25. Ninguno de estos enfoques, sin embargo, permite la investigación de BFU-e y UFC-e adultos en su estado fisiológico in vivo. La magnitud del desafío puede apreciarse cuando se recuerda que, según los ensayos de formación de colonias, estas células están presentes en la médula ósea adulta con una frecuencia de solo 0,025% y 0,3%, respectivamente⁶.

El protocolo descrito aquí es un nuevo enfoque citométrico de flujo basado en el análisis transcriptómico de células transcriptómicas de células de médula ósea de ratón Kit⁺ recién cosechadas (Kit es expresado por todas las poblaciones progenitoras tempranas de la médula ósea)¹. Nuestro enfoque contiene algunos marcadores de superficie celular que ya estaban en uso por Pronk et ^al.21,26. Se utilizaron transcriptomas unicelulares para determinar combinaciones de marcadores de superficie celular que identifican progenitores eritroides y otros progenitores hematopoyéticos tempranos (Figura 2). Específicamente, la fracción CD55+ de las células Kit⁺ negativas para linaje (Lin^–) puede subdividirse en cinco poblaciones, tres de las cuales producen segmentos contiguos de la trayectoria eritroide (Figura 2). Las identidades transcriptómicas de cada una de estas poblaciones se confirmaron mediante clasificación, seguido de scRNAseq y proyección de los transcriptomas unicelulares ordenados en el mapa transcriptómico original (la expresión génica en cada una de las cinco poblaciones y todo el conjunto de datos de médula ósea se puede explorar en https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)¹ . El potencial de destino celular de cada una de las poblaciones se confirmó mediante ensayos tradicionales de formación de colonias (Figura 2), así como un nuevo ensayo de destino unicelular de alto rendimiento ^1,27. Estos análisis muestran que el nuevo enfoque citométrico de flujo da como resultado un aislamiento de alta pureza de todos los progenitores BFU-e y CFU-e de la médula ósea y el bazo adultos frescos. Específicamente, la población 1 (P1) contiene solo UFC-e y ningún otro progenitor hematopoyético, y la población 2 (P2) contiene todos los progenitores BFU-e de la médula ósea y un pequeño número de UFC-e pero ningún otro progenitor¹. El protocolo detallado a continuación se ilustra con un experimento de ejemplo en ratones que fueron inyectados con solución salina o con la hormona estimulante de la eritropoyesis eritropoyetina (Epo).