ניתן לחלק את אריתרופואזיס לשני שלבים עיקריים: אריתרופואזיס מוקדם והבחנה סופנית אריתרואידית (איור 1)^1,2,3. באריתרופויאזיס מוקדם, תאי גזע המטופויאטיים מתחייבים לשושלת האריתרואידים ומולידים אבות אריתרואידים מוקדמים, שזוהו לראשונה בשנות השבעים בהתבסס על פוטנציאל יצירת המושבה שלהם בתווך מוצק למחצה 4,5,6,7,8,9 . באופן כללי, אבות אריתרואידים מחולקים לשתי קטגוריות: אבות קדמונים יותר שכל אחד מהם מוליד “פרץ” (צבר גדול של אשכולות תאים אריתרואידים קטנים יותר), הנקראים “אריתרואיד יחידה יוצר פרץ” או BFU-e ^4,5,6; וצאצאיהם, שכל אחד מהם יוצר אשכול או מושבה בודדים וקטנים של תאי אריתרואיד, הנקראים “אריתרואיד יחידה יוצרת מושבה” או CFU-e ^7,8,9. BFU-e ו-CFU-e עדיין לא מבטאים גנים אריתרואידים סופניים ואינם ניתנים לזיהוי מורפולוגית. לאחר מספר חלוקות תא של התחדשות עצמית או התפשטות, ה-CFU-e עובר מתג שעתוק שבו מושרים גנים אריתרואידיים כגון גלובין, ובכך עובר להתמיינות מסוף אריתרואידים (ETD)^1,10. במהלך ETD, אריתרובלסטים עוברים שלוש עד חמש חלוקות תאי התבגרות לפני שהם מתאחדים ליצירת רטיקולוציטים, אשר מבשילים לתאים אדומים.

אריתרובלסטים במהלך התמיינות סופנית סווגו במקור על סמך המורפולוגיה שלהם לפרואריתרובלסטים, בזופיליים, פוליכרומטיים ואורתוכרומטיים. הופעתה של ציטומטריה של זרימה אפשרה את המיון והבידוד הפרוספקטיביים שלהם בהתבסס על גודל התא (שנמדד על ידי פיזור קדימה, FSC) ושני סמני פני השטח של התא, CD71 ו-Ter119^11,12,13 (איור 1). זרימה זו וגישות ציטומטריות דומות¹⁴ חוללו מהפכה בחקר ההיבטים המולקולריים והתאיים של ETD, ומאפשרות ניתוח ספציפי לשלב התפתחותי של אריתרובלסטים in vivo ו– in vitro 10,15,16,17,18,19,20. גישת CD71/Ter119 משמשת כיום באופן שגרתי בניתוח של מבשרי אריתרואידים.

עד לאחרונה, גישה ציטומטרית דומה ונגישה לזרימה לבידוד פרוספקטיבי ישיר וטהור של CFU-e ו-BFU-e מרקמת עכבר חמקה מהחוקרים. במקום זאת, חוקרים השתמשו באסטרטגיות ציטומטריות זרימה המבודדות רק חלק קטן מאבות אבותיהם, לעתים קרובות בנוכחות תאים שאינם אריתרואידים המטהרים יחד בתוך אותן תת-קבוצות ציטומטריות של זרימה²¹. כתוצאה מכך, החקירה של BFU-e ו- CFU-e הוגבלה למערכות הבחנה חוץ גופית הגוזרות ומגבירות את BFU-e ו- CFU-e מאבות מח עצם קודמים. לאחר מכן ניתן ליישם אסטרטגיות ציטומטריות של זרימה המבדילות בין CFU-e ל-BFU-e בתרביות מועשרות באב אריתרואידי^22,23. גישה חלופית עושה שימוש ב- CFU-e ו- BFU-e עובריים, המועשרים מאוד בחלק Ter119-שלילי של כבד העובר של העכבר באמצע ההיריון 10,24,25. עם זאת, אף אחת מהגישות הללו אינה מאפשרת לחקור BFU-e ו-CFU-e בוגרים במצבם הפיזיולוגי in vivo. ניתן להעריך את גודל האתגר כאשר נזכרים כי בהתבסס על מבחני היווצרות מושבה, תאים אלה נמצאים במח העצם הבוגר בתדירות של 0.025% ו-0.3% בלבד,^{בהתאמה 6}.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא גישה ציטומטרית חדשנית של זרימה המבוססת על אנליזה של תעתיק חד-תאי של תאי מח עצם של עכבר ^Kit+ שזה עתה נקטפו (הערכה מתבטאת על ידי כל אוכלוסיות האב הקדום של מח העצם)¹. הגישה שלנו מכילה כמה סמני פני שטח של תאים שכבר היו בשימוש על ידי Pronk et ^al.21,26. תעתיקים חד-תאיים שימשו לקביעת שילובים של סמני פני השטח של התא שמזהים אריתרואידים ואבות המטופויאטיים מוקדמים אחרים (איור 2). באופן ספציפי, חלק CD55+ של תאי Kit⁺ שליליים לשושלת (Lin^–) עשוי להיות מחולק לחמש אוכלוסיות, ששלוש מהן מניבות מקטעים רציפים של מסלול האריתרואידים (איור 2). הזהויות השעתוק של כל אחת מאוכלוסיות אלה אושרו על ידי מיון, ולאחר מכן על ידי scRNAseq והשלכה של תעתיקים חד-תאיים ממוינים בחזרה למפת התעתיק המקורית (ניתן לחקור את ביטוי הגנים בכל אחת מחמש האוכלוסיות ואת כל מערך הנתונים של מח העצם ב-https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)¹ . פוטנציאל גורל התאים של כל אחת מהאוכלוסיות אושר באמצעות מבחני היווצרות מושבות מסורתיים (איור 2), כמו גם בדיקת גורל חד-תאית חדשה^בתפוקה גבוהה ^1,27. ניתוחים אלה מראים כי הגישה הציטומטרית החדשה של זרימה גורמת לבידוד בטוהר גבוה של כל אבות BFU-e ו- CFU-e של מח עצם וטחול בוגרים טריים. באופן ספציפי, אוכלוסייה 1 (P1) מכילה רק CFU-e ולא אבות המטופויאטיים אחרים, ואוכלוסיה 2 (P2) מכילה את כל אבות BFU-e של מח העצם ומספר קטן של CFU-e אך לא אבות אחרים¹. הפרוטוקול המפורט שלהלן מודגם עוד יותר בניסוי לדוגמה בעכברים שהוזרק להם מי מלח או עם ההורמון המגרה אריתרופואזיס אריתרופואיטין (Epo).