Identificação e Isolamento de Progenitores Eritróides da Unidade Formadora de Explosão e da Unidade Formadora de Colônias de Tecido de Camundongo por Citometria de Fluxo

A eritropoiese pode ser dividida em duas fases principais: eritropoiese precoce e diferenciação terminal eritróide (Figura 1)^1,2,3. Na eritropoiese precoce, as células-tronco hematopoiéticas se comprometem com a linhagem eritróide e dão origem a progenitores eritróides precoces, que foram identificados pela primeira vez na década de 1970 com base em seu potencial de formação de colônias em meio semissólido 4,5,6,7,8,9 . Em termos gerais, os progenitores eritróides são divididos em duas categorias: progenitores anteriores que dão origem a uma “explosão” (um grande agregado de aglomerados de células eritróides menores), denominada “unidade formadora de explosão eritróide” ou BFU-e ^4,5,6; e sua progênie, que forma um único e pequeno aglomerado ou colônia de células eritróides, denominado “unidade formadora de colônias eritróide” ou UFC-e ^7,8,9. BFU-e e UFC-e ainda não expressam genes eritróides terminais e não são morfologicamente reconhecíveis. Após uma série de divisões celulares de auto-renovação ou expansão, a UFC-e sofre uma troca transcricional na qual genes eritróides, como as globinas, são induzidos, fazendo a transição para a diferenciação terminal eritróide (ETD)^1,10. Durante a ETD, os eritroblastos sofrem de três a cinco divisões celulares maturacionais antes de se enuclearem para formar reticulócitos, que amadurecem em glóbulos vermelhos.

Os eritroblastos durante a diferenciação terminal foram originalmente classificados com base em sua morfologia em proeritroblastos, basofílicos, policromáticos e ortocromáticos. O advento da citometria de fluxo permitiu sua classificação prospectiva e isolamento com base no tamanho celular (medido por espalhamento para frente, FSC) e dois marcadores de superfície celular, CD71 e Ter119 11,12,13 (Figura 1). Essa e outras abordagens citométricas de fluxo similares 14 revolucionaram a investigação dos aspectos moleculares e celulares da DTE, permitindo a análise específica do estágio de desenvolvimento de eritroblastos in vivo e in vitro 10,15,16,17,18,19,20. A abordagem CD71/Ter119 é agora utilizada rotineiramente na análise de precursores eritróides.

Até recentemente, uma abordagem citométrica de fluxo semelhante e acessível para o isolamento prospectivo direto e de alta pureza da UFC-e e da BFU-e do tecido do rato tem escapado aos investigadores. Em vez disso, os pesquisadores têm utilizado estratégias citométricas de fluxo que isolam apenas uma fração desses progenitores, muitas vezes na presença de células não eritróides que copurificam dentro dos mesmos subconjuntos citométricos de fluxo²¹. Consequentemente, a investigação de BFU-e e CFU-e limitou-se a sistemas de diferenciação in vitro que derivam e amplificam BFU-e e CFU-e de progenitores anteriores da medula óssea. É possível, então, aplicar estratégias citométricas de fluxo que distinguem a UFC-e da UFC-e nessas culturas enriquecidas com progenitores eritróides^22,23. Uma abordagem alternativa faz uso da UFC-e fetal e da UPB-e, que são altamente enriquecidas na fração Ter119-negativa do fígado fetal do rato no meio da gestação 10,24,25. Nenhuma dessas abordagens, no entanto, permite a investigação de BFU-e e UFC-e adultas em seu estado fisiológico in vivo. A magnitude do desafio pode ser apreciada quando se lembra que, com base em ensaios de formação de colônias, essas células estão presentes na medula óssea adulta em uma frequência de apenas 0,025% e 0,3%, respectivamente⁶.

O protocolo aqui descrito é uma nova abordagem citométrica de fluxo baseada na análise transcriptômica de células da medula óssea de camundongos Kit⁺ recém-colhidas (o Kit é expresso por todas as populações progenitoras iniciais da medula óssea)¹. Nossa abordagem contém alguns marcadores de superfície celular que já estavam em uso por Pronk et ^al.21,26. Transcriptomas unicelulares foram utilizados para determinar combinações de marcadores de superfície celular que identificam eritróides e outros progenitores hematopoiéticos precoces (Figura 2). Especificamente, a fração CD55+ de células Kit⁺ de linhagem negativa (Lin^–) pode ser subdividida em cinco populações, três das quais produzem segmentos contíguos da trajetória eritróide (Figura 2). As identidades transcriptômicas de cada uma dessas populações foram confirmadas por classificação, seguida de scRNAseq e projeção dos transcriptomas de célula única classificados de volta ao mapa transcriptômico original (a expressão gênica em cada uma das cinco populações e todo o conjunto de dados da medula óssea podem ser explorados em https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)¹ . O potencial de destino celular de cada uma das populações foi confirmado usando ensaios tradicionais de formação de colônias (Figura 2), bem como um novo ensaio de destino unicelular de alto rendimento ^1,27. Essas análises mostram que a nova abordagem citométrica de fluxo resulta no isolamento de alta pureza de todos os progenitores de BFU-e e UFC-e da medula óssea adulta fresca e do baço. Especificamente, a população 1 (P1) contém apenas UFC-e e nenhum outro progenitor hematopoiético, e a população 2 (P2) contém todos os progenitores BFU-e da medula óssea e um pequeno número de UFC-e, mas nenhum outro progenitor¹. O protocolo detalhado abaixo é ainda ilustrado com um experimento de exemplo em camundongos que foram injetados com solução salina ou com o hormônio eritropoiese-estimulante eritropoietina (Epo).