Identificatie en isolatie van burst-forming unit en kolonievormende eenheid Erytroïde voorlopers uit muizenweefsel door flowcytometrie

Erytropoëse kan worden onderverdeeld in twee hoofdfasen: vroege erytropoëse en erytroïde terminale differentiatie (figuur 1)^1,2,3. In vroege erytropoëse binden hematopoëtische stamcellen zich aan de erytroïde afstamming en geven ze aanleiding tot vroege erytroïde voorlopers, die voor het eerst werden geïdentificeerd in de jaren 1970 op basis van hun kolonievormend potentieel in halfvast medium 4,5,6,7,8,9 . In grote lijnen zijn erytroïde voorlopers verdeeld in twee categorieën: eerdere voorlopercellen die elk aanleiding geven tot een “burst” (een groot aggregaat van kleinere erytroïde celclusters), genaamd “burst-forming unit erythroid” of BFU-e ^4,5,6; en hun nakomelingen, die elk een enkele, kleine erytroïde celcluster of kolonie vormen, genaamd “kolonievormende eenheid erytroïde” of CFU-e ^7,8,9. BFU-e en CFU-e brengen nog geen terminale erytroïde genen tot expressie en zijn morfologisch niet herkenbaar. Na een aantal zelfvernieuwings- of expansieceldelingen ondergaat de CFU-e een transcriptionele schakelaar waarbij erytroïde genen zoals globines worden geïnduceerd, waardoor deze overgaat in erytroïde terminale differentiatie (ETD)^1,10. Tijdens ETD ondergaan erytroblasten drie tot vijf rijpingsceldelingen voordat ze enucleeren om reticulocyten te vormen, die rijpen tot rode bloedcellen.

Erytroblasten tijdens terminale differentiatie werden oorspronkelijk geclassificeerd op basis van hun morfologie in proerytroblasten, basofiele, polychromatische en orthochromatische. De komst van flowcytometrie maakte hun prospectieve sortering en isolatie mogelijk op basis van celgrootte (gemeten door voorwaartse spreiding, FSC) en twee celoppervlakmarkers, CD71 en Ter119^11,12,13 (figuur 1). Deze en soortgelijke flowcytometrische benaderingen¹⁴ hebben een revolutie teweeggebracht in het onderzoek naar de moleculaire en cellulaire aspecten van ETD, waardoor ontwikkelingsstadiumspecifieke analyse van erytroblasten in vivo en in vitro 10,15,16,17,18,19,20 mogelijk is. De CD71/Ter119-benadering wordt nu routinematig gebruikt bij de analyse van erytroïde precursoren.

Tot voor kort is een vergelijkbare, toegankelijke flowcytometrische benadering voor directe, zeer zuivere prospectieve isolatie van CFU-e en BFU-e uit muizenweefsel onderzoekers ontgaan. In plaats daarvan hebben onderzoekers flowcytometrische strategieën gebruikt die slechts een fractie van deze voorlopers isoleren, vaak in de aanwezigheid van niet-erytroïde cellen die co-zuiveren binnen dezelfde flowcytometrische subsets²¹. Bijgevolg was het onderzoek van BFU-e en CFU-e beperkt tot in vitro differentiatiesystemen die BFU-e en CFU-e afleiden en versterken van eerdere beenmergvoorlopers. Het is dan mogelijk om flowcytometrische strategieën toe te passen die CFU-e onderscheiden van BFU-e in deze erytroïde voorloperverrijkte culturen^22,23. Een alternatieve benadering maakt gebruik van foetale CFU-e en BFU-e, die sterk verrijkt zijn in de Ter119-negatieve fractie van de foetale lever van de muis halverwege de zwangerschap 10,24,25. Geen van deze benaderingen maakt echter het onderzoek van volwassen BFU-e en CFU-e in hun fysiologische toestand in vivo mogelijk. De omvang van de uitdaging kan worden gewaardeerd wanneer eraan wordt herinnerd dat, op basis van kolonievormingstests, deze cellen aanwezig zijn in het volwassen beenmerg met een frequentie van respectievelijk slechts 0,025% en 0,3%⁶.

Het hier beschreven protocol is een nieuwe flowcytometrische benadering op basis van eencellige transcriptomische analyse van vers geoogste Kit⁺ beenmergcellen van muizen (Kit wordt uitgedrukt door alle vroege voorloperpopulaties van het beenmerg)¹. Onze aanpak bevat enkele celoppervlakmarkers die al in gebruik waren door Pronk et ^al.21,26. Eencellige transcriptomen werden gebruikt om combinaties van celoppervlakmarkers te bepalen die erytroïde en andere vroege hematopoëtische voorlopercellen identificeren (figuur 2). In het bijzonder kan de CD55⁺ fractie van lineage-negatieve (Lin^–) Kit⁺ cellen worden onderverdeeld in vijf populaties, waarvan er drie aaneengesloten segmenten van het erytroïde traject opleveren (figuur 2). De transcriptomische identiteiten van elk van deze populaties werden bevestigd door sortering, gevolgd door scRNAseq en projectie van de gesorteerde eencellige transcriptomen terug op de oorspronkelijke transcriptomische kaart (de genexpressie in elk van de vijf populaties en de volledige beenmergdataset kan worden onderzocht in https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)¹ . Het potentieel van het lot van elk van de populaties werd bevestigd met behulp van traditionele kolonievormingstests (figuur 2), evenals een nieuwe high-throughput single-cell fate assay ^1,27. Deze analyses tonen aan dat de nieuwe flowcytometrische benadering resulteert in een zeer zuivere isolatie van alle BFU-e en CFU-e voorlopers van vers volwassen beenmerg en milt. In het bijzonder bevat populatie 1 (P1) alleen CFU-e en geen andere hematopoëtische voorlopers, en populatie 2 (P2) bevat alle BFU-e-voorlopers van het beenmerg en een klein aantal CFU-e, maar geen andere voorlopers¹. Het gedetailleerde protocol hieronder wordt verder geïllustreerd met een voorbeeldexperiment bij muizen die werden geïnjecteerd met een zoutoplossing of met het erytropoësestimulerend hormoon erytropoëtine (Epo).