Identifizierung und Isolierung von Burst-bildenden Einheiten und koloniebildenden Einheiten erythroider Vorläuferzellen aus Mausgewebe mittels Durchflusszytometrie

Die Erythropoese kann in zwei Hauptphasen unterteilt werden: frühe Erythropoese und erythroide terminale Differenzierung (Abbildung 1)^1,2,3. Bei der frühen Erythropoese binden sich hämatopoetische Stammzellen an die erythroide Linie und führen zu frühen erythroiden Vorläuferzellen, die erstmals in den 1970er Jahren aufgrund ihres koloniebildenden Potenzials im halbfesten Medium 4,5,6,7,8,9 identifiziert wurden . Im Großen und Ganzen werden erythroide Vorläuferzellen in zwei Kategorien unterteilt: frühere Vorläufer, die jeweils zu einem “Burst” (einem großen Aggregat kleinerer erythroider Zellverbände) führen, der als “burst-bildende Einheit Erythroid” oder BFU-e ^4,5,6 bezeichnet wird; und ihre Nachkommen, die jeweils einen einzelnen, kleinen erythroiden Zellhaufen oder eine Kolonie bilden, die als “koloniebildende Einheit Erythroid” oder CFU-e ^7,8,9 bezeichnet wird. BFU-e und CFU-e exprimieren noch keine terminalen erythroiden Gene und sind morphologisch nicht erkennbar. Nach einer Reihe von Selbsterneuerungs- oder Expansionszellteilungen durchläuft die CFU-e einen Transkriptionsschalter, bei dem erythroide Gene wie Globine induziert werden, wodurch sie in eine erythroide terminale Differenzierung (ETD) ^{übergeht1,10}. Während der ETD durchlaufen Erythroblasten drei bis fünf reifende Zellteilungen, bevor sie zu Retikulozyten enukleieren, die zu roten Blutkörperchen heranreifen.

Erythroblasten während der terminalen Differenzierung wurden ursprünglich aufgrund ihrer Morphologie in Proerythroblasten, basophile, polychromatische und orthochromatische eingeteilt. Das Aufkommen der Durchflusszytometrie ermöglichte ihre prospektive Sortierung und Isolierung basierend auf der Zellgröße (gemessen durch Vorwärtsstreuung, FSC) und zwei Zelloberflächenmarkern, CD71 und Ter119^11,12,13 (Abbildung 1). Dieser und ähnliche durchflusszytometrische Ansätze 14 haben die Untersuchung der molekularen und zellulären Aspekte der ETD revolutioniert und ermöglichen eine entwicklungsstadienspezifische Analyse von Erythroblasten in vivo und in vitro 10,15,16,17,18,19,20. Der CD71/Ter119-Ansatz wird heute routinemäßig in der Analyse von erythroiden Vorstufen eingesetzt.

Bis vor kurzem war ein ähnlicher, zugänglicher durchflusszytometrischer Ansatz für die direkte, hochreine prospektive Isolierung von CFU-e und BFU-e aus Mausgewebe den Forschern entgangen. Stattdessen haben die Forscher durchflusszytometrische Strategien verwendet, die nur einen Bruchteil dieser Vorläuferzellen isolieren, oft in Gegenwart von nicht-erythroiden Zellen, die innerhalb derselben durchflusszytometrischen Untergruppen co-reinigen²¹. Folglich beschränkte sich die Untersuchung von BFU-e und CFU-e auf In-vitro-Differenzierungssysteme, die BFU-e und CFU-e von früheren Vorläuferzellen des Knochenmarks ableiten und amplifizieren. Es ist dann möglich, durchflusszytometrische Strategien anzuwenden, die CFU-e von BFU-e in diesen erythroid-mit Vorläuferzellen angereicherten Kulturen unterscheiden^22,23. Ein alternativer Ansatz verwendet fetale CFU-e und BFU-e, die in der Mitte der Schwangerschaft stark mit der Ter119-negativen Fraktion der fetalen Leber der Maus angereichert sind 10,24,25. Keiner dieser Ansätze erlaubt es jedoch, adulte BFU-e und CFU-e in ihrem physiologischen Zustand in vivo zu untersuchen. Das Ausmaß der Herausforderung kann eingeschätzt werden, wenn man sich daran erinnert, dass diese Zellen auf der Grundlage von Koloniebildungstests im adulten Knochenmark mit einer Häufigkeit von nur 0,025% bzw. 0,3% vorhanden sind⁶.

Das hier beschriebene Protokoll ist ein neuartiger durchflusszytometrischer Ansatz, der auf einer einzelzelligen transkriptomischen Analyse von frisch geernteten Kit⁺ Maus-Knochenmarkzellen basiert (Kit wird von allen frühen Vorläuferpopulationen des Knochenmarks exprimiert)¹. Unser Ansatz enthält einige Zelloberflächenmarker, die bereits von Pronk et ^al.21,26 verwendet wurden. Einzelzell-Transkriptome wurden verwendet, um Kombinationen von Zelloberflächenmarkern zu bestimmen, die erythroide und andere frühe hämatopoetische Vorläuferzellen identifizieren (Abbildung 2). Insbesondere kann der CD55⁺-Anteil von Lineage-negativen (Lin-) Kit^+-Zellen in fünf Populationen unterteilt werden, von denen drei zusammenhängende Segmente der erythroiden Trajektorie ergeben (Abbildung 2). Die transkriptomischen Identitäten jeder dieser Populationen wurden durch Sortierung bestätigt, gefolgt von scRNAseq und Projektion der sortierten Einzelzell-Transkriptome zurück auf die ursprüngliche transkriptomische Karte (die Genexpression in jeder der fünf Populationen und der gesamte Knochenmarkdatensatz können in https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html untersucht werden)¹ . Das Zellschicksalspotenzial jeder der Populationen wurde mit traditionellen Koloniebildungstests (Abbildung 2) sowie einem neuartigen Hochdurchsatz-Einzelzell-Schicksalstest^{bestätigt 1,27}. Diese Analysen zeigen, dass der neuartige durchflusszytometrische Ansatz zu einer hochreinen Isolierung aller BFU-e- und CFU-e-Vorläuferzellen von frischem adultem Knochenmark und Milz führt. Insbesondere enthält Population 1 (P1) nur CFU-e und keine anderen hämatopoetischen Vorläufer, und Population 2 (P2) enthält alle BFU-e-Vorläufer des Knochenmarks und eine kleine Anzahl von CFU-e, aber keine anderen Vorläufer¹. Das detaillierte Protokoll unten wird mit einem Beispielexperiment an Mäusen veranschaulicht, denen entweder Kochsalzlösung oder das Erythropoese-stimulierende Hormon Erythropoietin (Epo) injiziert wurden.