İn Vitro Nanoemülsiyon Aşısı Adjuvan Ophiopogonin D'nin Hücresel Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Aşılar, bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan hastalıkların önlenmesi ve tedavisinde önemli bir araçtır. Aşı formülasyonlarına adjuvanların ve dağıtım araçlarının uygun şekilde eklenmesi, antijenlerin immünojenitesini arttırmak ve uzun süreli immün yanıtlar oluşturmak için faydalıdır¹. Klasik adjuvan şaplara (alüminyum tuzu) ek olarak, şu anda pazarlanan aşılar için altı çeşit adjuvan vardır: MF59^2,3, AS04 3, AS03 3, AS01 ³, CpG1018⁴ ve Matrix-M⁵. Genel olarak, insan vücudu viral bir saldırıyla karşılaştığında, birinci ve ikinci savunma hatları (cilt, mukoza ve makrofajlar) virüsün temizlenmesinde öncülük eder ve son olarak, bağışıklık organlarını ve bağışıklık hücrelerini içeren üçüncü savunma hattı aktive edilir. Alüminyum ve alüminyum tuzları, 1920’lerin başından beri insan aşıları için en yaygın kullanılan adjuvanlar olmuştur ve etkili bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmıştır⁶. Bununla birlikte, antijen sunan hücrelerin (APC’ler) klasik adjuvanlar tarafından aktivasyonunun, immün hücreleri spesifik sitokin ve kemokin setleri üretmeye teşvik eden, adjuvanların çalıştığı mekanizma olduğu ve adjuvanların spesifik immün yanıtlar üzerinde sadece geçici etkiler göstermesinin nedenlerinden biri olabileceği öne sürülmüştür⁷. İnsan kullanımı için sınırlı lisanslı adjuvanların varlığı, etkili bağışıklık tepkilerini ortaya çıkaran aşıların geliştirilmesinde kısıtlayıcı bir faktördür⁸.

Şu anda, artan sayıda adjuvan çalışma, farelerde güçlü bir hücresel bağışıklık tepkisi indükleme yeteneğini göstermektedir. QS-21’in dengeli bir T-helper 1 (Th1) ve T-helper 2 (Th2) immün yanıtını indüklediği, daha yüksek seviyelerde antikor titreleri ürettiği ve bir adjuvan olarak korumayı uzattığı gösterilmiştir, ancak güçlü toksisitesi ve hemolitik özellikleri, bağımsız bir klinik adjuvan ^9,10 olarak gelişimini sınırlar. OP-D (ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside), Çin şifalı bitkisi Ophiopogon japonicas^4’ün kökünden izole edilen steroidal saponinlerden biridir. Ek olarak, Radix Ophiopogonis’te bulunan baş farmakolojik olarak aktif bileşendir (Shen Mai San) ve bazı farmakolojik özelliklere sahip olduğu bilinmektedir¹¹. Ayrıca, Liliaceae ailesinin bir üyesidir ve hücresel inflamasyon ve miyokard hasarında inhibitör ve koruyucu etkileri için yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin, OP-D, BALB / C farelerde DNCB ile indüklenen atopik dermatit benzeri lezyonları ve tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) inflamatuar HaCaT hücrelerini iyileştirir¹². Önemli olarak, OP-D, kardiyovasküler sistemin antioksidatif korumasını teşvik eder ve hem reaktif oksijen türlerinin üretimini azaltarak hem de mitokondriyal membran hasarını bozarak kalbi doksorubisin kaynaklı otofajik hasara karşı korur. Deneyler, OP-D’yi mono-desmosid ile almanın bağışıklık sağlığını artırmaya, beyaz kan hücresi sayımlarını ve DNA sentezini artırmaya ve antikorların daha uzun süre dayanmasına yardımcı olduğunu göstermiştir¹³. Daha önce OP-D’nin adjuvan etkisi olduğu bulunmuştur¹⁴.

Nanoemülsiyonlar, yüzey aktif maddeler, yağ, kosürfaktanlar ve su^12,15’in bir kombinasyonundan oluşan su içinde yağ nanoformülasyonlarıdır. Bu nanoaşı tasarımları, immün stimülasyonu arttırmak, antijenleri korumak ve dendritik hücre (DC) olgunlaşmasını teşvik etmek için antijenlerin ve adjuvanların birlikte kapsüllenmesine izin verir¹⁶. Taramadan elde edilen bu yeni adjuvanların gelişimi için, hücresel yanıt yeteneklerini değerlendirmek için uygun yöntemler bulmak önemlidir.

Bu protokolün amacı, adjuvanların fagositozu ve immün hücrelerin in vitro hücre kültüründeki ekspresyonunu artırıp artıramayacağını sistematik olarak değerlendirmek ve ana deneysel yöntemleri detaylandırmaktır. Deney dört alt bölüme ayrılmıştır: (1) OP-D ve NOD’nin L929 hücrelerine toksisitesi, hücre sayma kit-8 (CCK-8) testi ile belirlenir; (2) endokrin IFN-γ ve IL-17A’nın sitokin seviyeleri ve immünize farelerde karşılık gelen hücre sayıları splenosit stimülasyonu ve ELISpot testleri ile tespit edilir; (3) Adjuvan stimülasyondan sonra DC’lerin antijen sunum kabiliyeti konfokal mikroskopi kullanılarak gözlenir; ve (4) adjuvanlarla birlikte kültürlenmiş normal farelerde periton makrofajlarından (PM’ler) elde edilen süpernatantlarda üç çeşit sitokin, IL-1β, IL-6 ve TNF-α tespit edilir.