In vitro Bewertung der zellulären Aktivität des Nanoemulsionsimpfstoff-Adjuvans Ophiopogonin D

Impfstoffe sind ein wichtiges Mittel zur Verhütung und Behandlung von Infektionskrankheiten und nichtübertragbaren Krankheiten. Die angemessene Zugabe von Adjuvantien und Verabreichungsvehikeln zu Impfstoffformulierungen ist vorteilhaft für die Verbesserung der Immunogenität von Antigenen und die Erzeugung lang anhaltender Immunantworten¹. Neben dem klassischen Adjuvans Alaun (Aluminiumsalz) gibt es sechs Arten von Adjuvantien für Impfstoffe, die derzeit auf dem Markt sind: MF59^2,3, AS04 3, AS03 3, AS01 ^3, CpG1018⁴ und Matrix-M⁵. Wenn der menschliche Körper auf einen Virusangriff trifft, übernehmen im Allgemeinen die erste und zweite Verteidigungslinie (Haut, Schleimhaut und Makrophagen) die Führung bei der Beseitigung des Virus, und schließlich wird die dritte Verteidigungslinie, an der die Immunorgane und Immunzellen beteiligt sind, aktiviert. Aluminium und Aluminiumsalze sind seit den frühen 1920er Jahren die am häufigsten verwendeten Adjuvantien für Impfstoffe beim Menschen und lösen eine wirksame angeborene Immunantwort aus⁶. Es wurde jedoch vorgeschlagen, dass die Aktivierung von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) durch klassische Adjuvantien, die die Immunzellen dazu anregen, spezifische Sätze von Zytokinen und Chemokinen zu erzeugen, der Mechanismus ist, durch den Adjuvantien wirken und einer der Gründe sein kann, warum Adjuvantien nur vorübergehende Wirkungen auf spezifische Immunantworten ausüben⁷. Das Vorhandensein von begrenzt zugelassenen Adjuvantien für den menschlichen Gebrauch ist ein einschränkender Faktor für die Entwicklung von Impfstoffen, die wirksame Immunantworten hervorrufen⁸.

Derzeit zeigen immer mehr adjuvante Studien die Fähigkeit, eine starke zelluläre Immunantwort bei Mäusen zu induzieren. Es wurde gezeigt, dass QS-21 eine ausgewogene T-Helfer-1 (Th1) und T-Helfer 2 (Th2) Immunantwort induziert, höhere Konzentrationen von Antikörpertitern produziert und den Schutz als Adjuvans verlängert, aber seine starke Toxizität und hämolytischen Eigenschaften begrenzen seine Entwicklung als eigenständiges klinisches Adjuvans ^9,10. OP-D (Ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranosid) ist eines der steroidalen Saponine, die aus der Wurzel der chinesischen Heilpflanze Ophiopogon japonicas⁴ isoliert wurden. Darüber hinaus ist es die pharmakologisch aktive Hauptkomponente (Shen Mai San), die in Radix Ophiopogonis gefunden wird und von der bekannt ist, dass sie bestimmte pharmakologische Eigenschaften aufweist¹¹. Darüber hinaus ist es ein Mitglied der Familie der Liliaceae und wird häufig wegen seiner hemmenden und schützenden Wirkung bei zellulären Entzündungen und Myokardverletzungen verwendet. Zum Beispiel verbessert OP-D DNCB-induzierte atopische Dermatitis-ähnliche Läsionen und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) entzündliche HaCaT-Zellen in BALB/c-Mäusen¹². Wichtig ist, dass OP-D den antioxidativen Schutz des Herz-Kreislauf-Systems fördert und das Herz vor Doxorubicin-induzierten autophagischen Verletzungen schützt, indem es sowohl die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies als auch die Schädigung der mitochondrialen Membran reduziert. Experimente haben gezeigt, dass die Einnahme von OP-D mit Monodesmosid dazu beiträgt, die Immungesundheit zu stärken, die Anzahl der weißen Blutkörperchen und die DNA-Synthese zu erhöhen und die Antikörper länger haltbar zu machen¹³. Es wurde bereits festgestellt, dass OP-D eine adjuvante Wirkung^{hat 14}.

Nanoemulsionen sind Öl-in-Wasser-Nanoformulierungen, die aus einer Kombination von Tensiden, Öl, Cotensiden und Wasser^12,15 bestehen. Diese Nanoimpfstoff-Designs ermöglichen es, Antigene und Adjuvantien zusammen zu verkapseln, um die Immunstimulation zu verbessern, die Antigene zu schützen und die Reifung der dendritischen Zellen (DC) zu fördern¹⁶. Für die Entwicklung dieser neuartigen Adjuvantien, die aus dem Screening gewonnen werden, ist es wichtig, geeignete Methoden zu finden, um ihre zellulären Reaktionsfähigkeiten zu bewerten.

Ziel dieses Protokolls ist es, systematisch zu bewerten, ob Adjuvantien die Phagozytose und die Expression von Immunzellen in In-vitro-Zellkulturen verbessern können, und die wichtigsten experimentellen Methoden zu erläutern. Das Experiment ist in vier Unterabschnitte unterteilt: (1) Die Toxizität von OP-D und NOD für L929-Zellen wird durch den Zellzählkit-8 (CCK-8) Assay bestimmt; (2) Die Zytokinspiegel von endokrinem IFN-γ und IL-17A und die entsprechenden Zellzahlen in immunisierten Mäusen werden durch Splenozytenstimulation und ELISpot-Assays nachgewiesen. (3) Die Antigenpräsentationsfähigkeit von DCs nach adjuvanter Stimulation wird mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet. und (4) die drei Arten von Zytokinen, IL-1β, IL-6 und TNF-α, in den Überständen nachgewiesen werden, die aus Peritonealmakrophagen (PMs) in normalen Mäusen gewonnen werden, die mit Adjuvantien kokultiviert wurden.