Summary

インビトロ ナノエマルジョンワクチンアジュバントオフィオポゴニンDの細胞活性評価

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

このプロトコルは、ナノエマルジョンオフィオポゴニンDアジュバントが効果的な細胞性免疫応答を促進するかどうかを評価するための詳細な方法を提示する。

Abstract

ワクチンの主成分として、アジュバントは、抗原に関連する強力で広範囲にわたる自然免疫応答および適応免疫応答を直接誘導または増強することができます。オフィオポゴン・ジャポニクスの植物から抽出した精製成分であるオフィオ ポゴニンD(OP-D)は、ワクチンアジュバントとして有用であることが分かっている。OP−Dの低い溶解性および毒性の問題は、ナノエマルジョンオフィオポゴニンD(NOD)を調製するために低エネルギー乳化法を使用することによって効果的に克服することができる。本稿では、細胞活性評価のための一連の in vitro プロトコルについて検討するL929の細胞傷害効果を、細胞計数キット−8アッセイを用いて決定した。次いで、免疫マウスからの脾細胞の刺激および培養後の分泌サイトカインレベルおよび対応する免疫細胞数を、ELISAおよびELISpot法により検出した。さらに、C57BL/6マウスから単離し、GM-CSFとIL-4とのインキュベーション後に成熟させた骨髄由来樹状細胞(BMDC)における抗原取り込み能をレーザー走査型共焦点顕微鏡(CLSM)によって観察した。重要なことに、マクロファージの活性化は、ブランクマウスの腹膜マクロファージ(PM)をアジュバントと24時間共培養した後、ELISAキットによってIL-1β、IL-6、および腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)サイトカインのレベルを測定することによって確認されました。このプロトコルが、新しいワクチンアジュバントの細胞応答の有効性を評価するための直接的かつ効果的な実験的アプローチを他の研究者に提供することが期待されています。

Introduction

ワクチンは、感染症や非感染性疾患を予防・治療するための重要な手段です。ワクチン製剤へのアジュバントとデリバリービヒクルの適切な添加は、抗原の免疫原性を高め、長期的な免疫応答を生成するのに有益です1。現在市販されているワクチン用アジュバントには、従来のアジュバントミョウバン(アルミニウム塩)の他に、MF59 2,3、AS04 3、AS03 3、AS01 3、CpG10184Matrix-M5の6種類があります。一般に、人体がウイルスの攻撃に遭遇すると、第1および第2の防御線(皮膚、粘膜、マクロファージ)が主導権を握ってウイルスを除去し、最後に免疫器官と免疫細胞を含む第3の防御線が活性化されます。アルミニウム塩とアルミニウム塩は、1920年代初頭からヒトワクチンに最も広く使用されているアジュバントであり、効果的な自然免疫応答を誘発しています6。しかし、免疫細胞を刺激してサイトカインとケモカインの特定のセットを生成する古典的なアジュバントによる抗原提示細胞(APC)の活性化は、アジュバントが機能するメカニズムであり、アジュバントが特定の免疫応答に一時的な影響のみを及ぼす理由の1つである可能性が提案されています7。ヒトが使用するための限られた認可されたアジュバントの存在は、効果的な免疫応答を誘発するワクチンを開発するための制限要因です8

現在、ますます多くのアジュバント研究が、マウスにおいて強力な細胞性免疫応答を誘導する能力を実証している。QS-21は、バランスの取れたTヘルパー1(Th1)およびTヘルパー2(Th2)免疫応答を誘導し、より高いレベルの抗体力価を生成し、アジュバントとしての保護を延長することが示されていますが、その強力な毒性と溶血特性は、スタンドアロンの臨床アジュバントとしての開発を制限します9,10。OP-D(ルスコゲニン-O-α-L-ラムノピラノシー1-(1→2)-β-D-キシロピラノシル-(1→3)-β-D-フコピラノシド)は、中国の薬用植物オフィオポゴンジャポニカス4の根から単離されたステロイドサポニンの1つです。さらに、それは基数オフィオポゴニスに見られる主要な薬理学的に活性な成分(シェンマイサン)であり、特定の薬理学的特性を持っていることが知られています11。さらに、ユリ科のメンバーであり、細胞の炎症や心筋損傷における抑制および保護効果のために広く使用されています。例えば、OP-Dは、BALB/cマウスにおいてDNCB誘発性アトピー性皮膚炎様病変および腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)炎症性HaCaT細胞を改善する12。重要なことに、OP-Dは、活性酸素種の生成とミトコンドリア膜損傷の両方を減らすことにより、心臓血管系の抗酸化保護を促進し、ドキソルビシン誘発性オートファジー損傷から心臓を保護します。実験によると、モノデスモシドと一緒にOP-Dを服用すると、免疫の健康を高め、白血球数とDNA合成を増やし、抗体を長持ちさせるのに役立ちます13。OP−Dがアジュバント効果を有することが以前に見出された14

ナノエマルジョンは、界面活性剤、油、共界面活性剤、および水の組み合わせからなる水中油型ナノ製剤である12,15。これらのナノワクチン設計により、抗原とアジュバントを一緒にカプセル化して、免疫刺激を強化し、抗原を保護し、樹状細胞(DC)の成熟を促進することができます16。スクリーニングから得られるこれらの新規アジュバントの開発には、それらの細胞応答能力を評価するための適切な方法を見つけることが重要です。

このプロトコルの目的は、アジュバントが in vitro 細胞培養における食作用と免疫細胞の発現を増強できるかどうかを体系的に評価し、主な実験方法を詳しく説明することです。実験は4つのサブセクションに分かれています:(1)L929細胞に対するOP-DおよびNODの毒性は、細胞計数キット-8(CCK-8)アッセイによって決定されます。(2)免疫マウスにおける内分泌IFN-γおよびIL-17Aのサイトカインレベルおよび対応する細胞数を脾細胞刺激およびELISpotアッセイによって検出する;(3)アジュバント刺激後のDCの抗原提示能力を共焦点顕微鏡を用いて観察する;(4)アジュバントと共培養したノーマルマウスの腹膜マクロファージ(PM)から得られた上清中にIL-1β、IL-6、TNF-αの3種類のサイトカインが検出される。

Protocol

すべての細胞実験は、基本的な手術室、緩衝室、滅菌培養室、同定および分析室を備えた細胞工学実験室で実施されました。作業環境と条件には、微生物汚染やその他の有害な要因はありませんでした。動物実験は実験動物の管理と使用に関するガイドラインに基づいて行われ、第三軍事医科大学の実験動物福祉倫理委員会によって承認されました。 1.オートクレー…

Representative Results

アジュバントOP−DおよびNODの細胞活性評価を、プロトコールに従って インビトロ で完了した。L929線維芽細胞は、NODの in vitro 毒性試験に有用なスクリーニングモデルです(図1)。脾臓の炎症性サイトカインレベルの定量化は、研究者が免疫応答をよりよく理解するのに役立ちます(図2)。ELISpotによるCTLのモニタリングは、臨床試験にお?…

Discussion

サブユニットワクチンは優れた安全性を提供しますが、免疫原性は低くなります。免疫原性を高めるための主な戦略は、抗原を物理的に吸着またはアジュバントと結合させ、それらを薬物送達システムに組み込んで、DCによる取り込みと提示を促進することです。 キライアサポニンとその誘導体などの天然植物サポニンは非常に毒性が高く、ヒトワクチンの開発には適していません<sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、中国国家重点研究開発プログラムの助成金番号2021YFC2302603、中国国家自然科学基金会プログラムの助成金番号31670938、32070924、82041045、および32000651、助成金番号2014jcyjA0107および重慶の自然科学財団プロジェクトプログラムの助成金番号2019jcyjA-msxmx0159、重慶大学院研究イノベーションプロジェクトの助成金番号CYS21519、 陸軍医科大学特別プロジェクトの助成金番号2020XBK24、および大学生向けの国家イノベーションおよび起業家精神プログラムの助成金番号202090031021。

Materials

0.25% Trypsin-EDTA (1x) GIBCO, USA 25200056
96-well filter plates Millipore. Billerica, MA CLS3922
AlPO4 General Chemical Company, USA null
Automated Cell Counter Countstar, China IC1000
BALB/c mice and C57BL/6 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd null
caprylic/capric triglyceride (GTCC) Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China null
CCK-8 kits Dojindo, Japan CK04
Cell Counting Plate Costar, Corning, USA CO010101
Cell Sieve biosharp, China BS-70-CS
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D9542
DMEM basic(1x) medium GIBCO, USA C11885500BT
DSZ5000X Inverted Microscope Nikon,Japan DSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35) Mumbai, India null
ELISpot classic AID, Germany ELR06
Fetal Bovine Serum GIBCO, USA 10099141C
Full-function Microplate Reader Thermo Fisher Scientific, USA VL0000D2
GFP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P42212
Glutamax Invitrogen, USA 35050061
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor GM-CSF, R&D Systems, USA 315-03
HEPES Invitrogen, USA 15630106
HF 90/240 Incubator Heal Force, Switzerland null
IL-4 PeproTech, USA 042149
L929 cell line FENGHUISHENGWU, China  NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss, Germany LSM 980
MONTANE 85 PPI SEPPIC, France L12910
MONTANOX 80 PPI SEPPIC, France 36372K
Mouse IFN-γ ELISA kit Dakewe, China 1210002
Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit Dakewe, China DKW22-2000-096
Mouse IL-17A ELISA kit Dakewe, China 1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit ebiosciences, USA 3521-4HPW-2
Mouse IL-1β ELISA kit Dakewe, China 1210122
Mouse IL-6 ELISA kit Dakewe, China 1210602
Mouse TNF-α ELISA kit Dakewe, China 1217202
Non-essential amino acids(100x) Invitrogen, USA 11140050
Ophiopogonin-D Chengdu Purui Technology Co. Ltd 945619-74-9
Penicillin-Streptomycin Solution Invitrogen, USA 15070063
Phalloidin Solarbio, China CA1620
Phosphate Buffered Saline ZSGB-BIO, China ZLI-9062
Red Blood Cell Lysis Buffer Solarbio, China R1010
RPMI 1640 medium Hyclone (Life Technology), USA SH30809.01
Sodium pyruvate(100 mM) Invitrogen, USA 11360070
Squalene Sigma, USA S3626
β- Mercaptoethanol Invitrogen, USA 21985023

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Luo, X., Tong, Y., Zeng, X., Ye, Y., Yang, Y., Song, Z., Zhang, Z., Li, H., Gao, J., Mao, X., Zeng, H., Zou, Q., Sun, H. In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D. J. Vis. Exp. (190), e64291, doi:10.3791/64291 (2022).

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