In vitro Valutazione dell'attività cellulare del vaccino adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D

I vaccini sono un mezzo importante per prevenire e curare le malattie infettive e non trasmissibili. L’aggiunta appropriata di adiuvanti e veicoli di somministrazione alle formulazioni dei vaccini è utile per migliorare l’immunogenicità degli antigeni e generare risposte immunitarie durature¹. Oltre al classico allume adiuvante (sale di alluminio), ci sono sei tipi di adiuvanti per i vaccini che sono attualmente commercializzati: MF59^2,3, AS04 3, AS03 3, AS01 ³, CpG1018⁴ e Matrix-M⁵. Generalmente, quando il corpo umano incontra un attacco virale, la prima e la seconda linea di difesa (pelle, mucosa e macrofagi) prendono il comando nell’eliminazione del virus e, infine, viene attivata la terza linea di difesa, che coinvolge gli organi immunitari e le cellule immunitarie. L’alluminio e i sali di alluminio sono stati gli adiuvanti più utilizzati per i vaccini umani sin dai primi anni 1920, suscitando un’efficace risposta immunitaria innata⁶. Tuttavia, è stato proposto che l’attivazione delle cellule presentanti l’antigene (APC) da parte degli adiuvanti classici, che stimola le cellule immunitarie a generare serie specifiche di citochine e chemochine, è il meccanismo attraverso il quale funzionano gli adiuvanti e può essere uno dei motivi per cui gli adiuvanti esercitano solo effetti transitori su specifiche risposte immunitarie⁷. La presenza di adiuvanti autorizzati limitati per uso umano è un fattore restrittivo per lo sviluppo di vaccini che suscitano risposte immunitarie efficaci⁸.

Attualmente, un numero crescente di studi adiuvanti sta dimostrando la capacità di indurre una forte risposta immunitaria cellulare nei topi. QS-21 ha dimostrato di indurre una risposta immunitaria bilanciata T-helper 1 (Th1) e T-helper 2 (Th2), produrre livelli più elevati di titoli anticorpali e prolungare la protezione come adiuvante, ma la sua forte tossicità e le proprietà emolitiche limitano il suo sviluppo come adiuvante clinico autonomo ^9,10. OP-D (ruscogenina-O-α-L-ramnopiranosia1-(1→2)-β-D-xilopiranosil-(1→3)-β-D-fucopyranoside) è una delle saponine steroidee isolate dalla radice della pianta medicinale cinese Ophiopogon japonicas⁴. Inoltre, è il principale componente farmacologicamente attivo (Shen Mai San) trovato in Radix Ophiopogonis ed è noto per avere alcune proprietà farmacologiche¹¹. Inoltre, è un membro della famiglia delle Liliaceae ed è ampiamente utilizzato per i suoi effetti inibitori e protettivi nell’infiammazione cellulare e nel danno miocardico. Ad esempio, OP-D migliora le lesioni simili alla dermatite atopica indotte da DNCB e le cellule HaCaT infiammatorie del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) nei topi BALB / c¹². È importante sottolineare che OP-D promuove la protezione antiossidante del sistema cardiovascolare e protegge il cuore dal danno autofagico indotto dalla doxorubicina riducendo sia la generazione di specie reattive dell’ossigeno che interrompendo il danno alla membrana mitocondriale. Gli esperimenti hanno dimostrato che l’assunzione di OP-D con mono-desmoside aiuta a migliorare la salute immunitaria, aumentare la conta dei globuli bianchi e la sintesi del DNA e far durare più a lungo gli anticorpi¹³. In precedenza è stato riscontrato che l’OP-D ha un effetto adiuvante¹⁴.

Le nanoemulsioni sono nanoformulazioni olio-in-acqua composte da una combinazione di tensioattivi, olio, tensioattivi e acqua^12,15. Questi progetti di nanovaccini consentono di incapsulare insieme antigeni e adiuvanti per migliorare la stimolazione immunitaria, proteggere gli antigeni e promuovere la maturazione delle cellule dendritiche (DC)¹⁶. Per lo sviluppo di questi nuovi adiuvanti ottenuti dallo screening, è importante trovare metodi appropriati per valutare le loro capacità di risposta cellulare.

Lo scopo di questo protocollo è quello di valutare sistematicamente se gli adiuvanti possono migliorare la fagocitosi e l’espressione di cellule immunitarie in colture cellulari in vitro e di elaborare i principali metodi sperimentali. L’esperimento è diviso in quattro sottosezioni: (1) la tossicità di OP-D e NOD per le cellule L929 è determinata dal test del kit-8 (CCK-8) per il conteggio delle cellule; (2) i livelli di citochine di IFN-γ endocrino e IL-17A e il numero di cellule corrispondenti nei topi immunizzati sono rilevati mediante stimolazione degli splenociti e saggi ELISpot; (3) la capacità di presentazione dell’antigene delle DC dopo stimolazione adiuvante è osservata utilizzando la microscopia confocale; e (4) vengono rilevati i tre tipi di citochine, IL-1β, IL-6 e TNF-α, nei supernatanti ottenuti da macrofagi peritoneali (PM) in topi normali in cocoltura con adiuvanti.