In vitro Evaluación de la actividad celular del adyuvante de la vacuna de nanoemulsión Ophiopogonin D
Summary
El protocolo presenta métodos detallados para evaluar si el adyuvante de bioemulsión ofiopogonina D promueve respuestas inmunes celulares efectivas.
Abstract
Como ingrediente principal de las vacunas, los adyuvantes pueden inducir o mejorar directamente las respuestas inmunes potentes, generalizadas, innatas y adaptativas asociadas con los antígenos. Se ha encontrado que la ofiopogonina D (OP-D), un componente purificado extraído de la planta Ophiopogon japonicus, es útil como adyuvante de la vacuna. Los problemas de la baja solubilidad y toxicidad de OP-D se pueden superar eficazmente mediante el uso de un método de emulsificación de baja energía para preparar la nanoemulsión de ofiopogonina D (NOD). En este artículo, se examinan una serie de protocolos in vitro para la evaluación de la actividad celular. Los efectos citotóxicos de L929 se determinaron mediante un ensayo de kit de conteo celular-8. Luego, los niveles de citoquinas secretadas y el número de células inmunes correspondientes después de la estimulación y el cultivo de esplenocitos de ratones inmunizados se detectaron mediante métodos ELISA y ELISpot. Además, la capacidad de absorción de antígenos en células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC), que se aislaron de ratones C57BL / 6 y maduraron después de la incubación con GM-CSF más IL-4, se observó mediante microscopía confocal de barrido láser (CLSM). Es importante destacar que la activación de los macrófagos se confirmó midiendo los niveles de IL-1β, IL-6 y citoquinas del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) mediante kits ELISA después de cocultivar macrófagos peritoneales (PM) de ratones en blanco con el adyuvante durante 24 h. Se espera que este protocolo proporcione a otros investigadores enfoques experimentales directos y efectivos para evaluar la eficacia de la respuesta celular de los nuevos adyuvantes de vacunas.
Introduction
Las vacunas son un medio importante para prevenir y tratar las enfermedades infecciosas y no transmisibles. La adición adecuada de adyuvantes y vehículos de administración a las formulaciones de vacunas es beneficiosa para mejorar la inmunogenicidad de los antígenos y generar respuestas inmunes duraderas1. Además del alumbre adyuvante clásico (sal de aluminio), hay seis tipos de adyuvantes para vacunas que se comercializan actualmente: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 y Matrix-M5. Generalmente, cuando el cuerpo humano se encuentra con un ataque viral, la primera y segunda línea de defensa (piel, mucosa y macrófagos) toman la delantera en la eliminación del virus, y finalmente, se activa la tercera línea de defensa, que involucra los órganos inmunes y las células inmunes. El aluminio y las sales de aluminio han sido los adyuvantes más utilizados para las vacunas humanas desde principios de la década de 1920, provocando una respuesta inmune innata efectiva6. Sin embargo, se ha propuesto que la activación de las células presentadoras de antígeno (APC) por adyuvantes clásicos, que estimula a las células inmunes para generar conjuntos específicos de citoquinas y quimiocinas, es el mecanismo por el cual funcionan los adyuvantes y puede ser una de las razones por las cuales los adyuvantes ejercen solo efectos transitorios sobre respuestas inmunes específicas7. La presencia de adyuvantes autorizados limitados para uso humano es un factor restrictivo para el desarrollo de vacunas que provoquen respuestas inmunes efectivas8.
Actualmente, un número creciente de estudios adyuvantes están demostrando la capacidad de inducir una fuerte respuesta inmune celular en ratones. Se ha demostrado que QS-21 induce una respuesta inmune equilibrada de T-helper 1 (Th1) y T-helper 2 (Th2), produce niveles más altos de títulos de anticuerpos y prolonga la protección como adyuvante, pero su fuerte toxicidad y propiedades hemolíticas limitan su desarrollo como adyuvante clínico independiente 9,10. OP-D (ruscogenina-O-α-L-ramnopiranosia1-(1→2)-β-D-xilopiranosil-(1→3)-β-D-fucopiranósido) es una de las saponinas esteroides aisladas de la raíz de la planta medicinal china Ophiopogon japonicas4. Además, es el principal componente farmacológicamente activo (Shen Mai San) que se encuentra en Radix Ophiopogonis y se sabe que tiene ciertas propiedades farmacológicas11. Además, es un miembro de la familia Liliaceae y es ampliamente utilizado por sus efectos inhibitorios y protectores en la inflamación celular y la lesión miocárdica. Por ejemplo, OP-D mejora las lesiones similares a la dermatitis atópica inducida por DNCB y las células inflamatorias HaCaT del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) en ratones BALB/c12. Es importante destacar que OP-D promueve la protección antioxidante del sistema cardiovascular y protege el corazón contra la lesión autofágica inducida por doxorrubicina al reducir la generación de especies reactivas de oxígeno e interrumpir el daño de la membrana mitocondrial. Los experimentos han demostrado que tomar OP-D con monodesósido ayuda a mejorar la salud inmunológica, aumentar el recuento de glóbulos blancos y la síntesis de ADN, y hacer que los anticuerpos duren más13. Anteriormente se ha encontrado que la OP-D tiene un efecto adyuvante14.
Las nanoemulsiones son nanoformulaciones de aceite en agua compuestas por una combinación de tensioactivos, aceite, cosurfactantes y agua12,15. Estos diseños de nanovacunas permiten encapsular antígenos y adyuvantes juntos para mejorar la estimulación inmune, proteger los antígenos y promover la maduración de las células dendríticas (DC)16. Para el desarrollo de estos nuevos adyuvantes obtenidos del cribado, es importante encontrar métodos apropiados para evaluar sus capacidades de respuesta celular.
El propósito de este protocolo es evaluar sistemáticamente si los adyuvantes pueden mejorar la fagocitosis y la expresión de células inmunes en cultivo celular in vitro y elaborar los principales métodos experimentales. El experimento se divide en cuatro subsecciones: (1) la toxicidad de OP-D y NOD para las células L929 se determina mediante el ensayo del kit de conteo de células-8 (CCK-8); (2) los niveles de citoquinas de IFN-γ endocrino e IL-17A y el número de células correspondiente en ratones inmunizados se detectan mediante estimulación de esplenocitos y ensayos ELISpot; (3) la capacidad de presentación de antígenos de las CD después de la estimulación adyuvante se observa mediante microscopía confocal; y (4) se detectan los tres tipos de citocinas, IL-1β, IL-6 y TNF-α, en los sobrenadantes obtenidos de macrófagos peritoneales (PM) en ratones normales cocultivados con adyuvantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las vacunas de subunidades proporcionan una excelente seguridad pero una inmunogenicidad deficiente. La estrategia principal para mejorar la inmunogenicidad es adsorber físicamente o acoplar antígenos con adyuvantes e incorporarlos a los sistemas de administración de fármacos para promover la absorción y presentación por parte de las DC. Las saponinas vegetales naturales como la saponina quillaia y sus derivados son altamente tóxicas y no son adecuadas para el desarrollo de vacunas humanas17</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la subvención No. 2021YFC2302603 del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China, subvenciones No. 31670938, 32070924, 82041045 y 32000651 del Programa de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, subvenciones No. 2014jcyjA0107 y No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Programa de Proyectos de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing, subvención No. CYS21519 del Proyecto de Investigación e Innovación de Postgrado de Chongqing, subvención No. 2020XBK24 de los proyectos especiales de la Universidad Médica del Ejército, y subvención No. 202090031021 del Programa Nacional de Innovación y Emprendimiento para estudiantes universitarios.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
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