ホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレット免疫組織化学制御のための標準化された処理(英語)

このプロトコルは、下流の免疫組織化学および in situ ハイブリダイゼーション研究のコントロールとして使用できるホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレットを生成する方法論を説明しています。このプロトコルに記載されている組織学方法論は、多様な範囲の癌および初代細胞株に適用可能であり、主にこれらのペレットを製造するために日常的な組織学技術を適応させる^17、18。処理および埋め込まれる場合、ペレットは組織と同様の方法で使用できます。これには、免疫組織化学実験のための熱誘導および酵素抗原賦活化プロトコルでの使用が含まれます。このプロトコルで使用される方法論の1つの目的は、プロセス全体を通して細胞の形態と抗原性を維持することです。そのため、形態や抗原性の両方の変化が比較的緩やかなEDTAが細胞の剥離に使用されます。これは、物理的な混乱などの他のアプローチが実行可能ではないということではありません。ただし、細胞を剥離するためのアプローチでは、その過程で細胞が損傷しないようにする必要があります。このプロトコルの2番目の目的は、同じ固定液、固定比、処理スケジュール(固定、脱水、透明化、およびパラフィン浸潤)、および埋め込み技術を使用して、組織と同様の方法で細胞を固定および処理し、ダウンストリームアッセイの同等のコントロールとして機能できるようにすることです。したがって、細胞ペレットを生成するために使用される固定および処理アプローチは、組織に使用されるアプローチを模倣する必要があります。

このレポートに記載されているプロトコルは、細胞が固定前に剥離、収集、遠心分離されるため、病原性細菌やウイルスに感染した細胞などの感染因子を含む細胞を処理するようには適合されていません。研究者は、剥離前に細胞を固定するためのプロトコルを検討するかもしれませんが、これには、細胞の形態を乱すことなく細胞を収集するためのさらなる最適化が必要になります。さらに、感染性病原体を有する細胞の固定時間および取り扱い条件は、感染因子および関連する施設のバイオセーフティプロトコルに基づいて追加の考慮事項を必要とする。

ホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレットは、明確に定義されたタンパク質発現レベル¹⁰を有するという点で他に類を見ない利点がある。がんおよび内因性細胞株は、さまざまなレベルのタンパク質発現を持つ細胞の選択を提供しますが、遺伝子工学技術により、科学者は目的のタンパク質を過剰発現し、CRISPR技術を使用して目的のコード遺伝子を切除または挿入することにより、タンパク質発現をモデル化できます^20,21。.細胞株で過剰発現したタンパク質の欠点は、内因性タンパク質レベル²²を表していない可能性があるため、アッセイの感度の尺度として不十分であることです。対照的に、内因性細胞株および癌細胞株の両方が内因性発現レベルをよりよく表すことができ、同族株におけるコード遺伝子のCRISPR媒介欠失は、対応するネガティブコントロールとして役立ち得る。さらに、さまざまなレベルのタンパク質発現を持つ内因性細胞株またはがん細胞株は、最終的な抗体希釈液を選択し、アッセイの感度を最もよく理解するための滴定実験に最適です(図2)。どの細胞株を使用するかの決定は、個々の実験ニーズに基づいて行われるべきであり、多くの場合、アプローチの組み合わせを利用します。

抗体が目的のタンパク質を検出できるかどうかを評価することに加えて、細胞株のパネルを使用して抗体の特異性を定義できます。例えば、密接に関連するタンパク質のファミリーを個別に発現する細胞株のパネルを使用して、抗体が個々のタンパク質に特異的であるかどうか、または他の密接に関連するタンパク質も検出するかどうかをテストできます。より精巧なコントロールには、CRISPRノックインまたは過剰発現のいずれかを介して、検出されている特定のシグナル伝達イベントを受けることができない点突然変異(例えば、リン酸化特異的抗体を評価する際の特定のリン酸化部位の突然変異)を有するタンパク質を発現する細胞株を使用することが含まれる場合があります。これらはより複雑なアプローチですが、抗体が特定の状況下で標識のみを使用したことを確認するために必要になる場合があります¹⁰。

細胞株の遺伝子操作は均質な細胞集団を生成しない可能性があることに注意することが重要です。例えば、過剰発現細胞株におけるトランスフェクション効率は通常100%ではなく、一部の細胞は目的のタンパク質を過剰発現させない場合があります。標準的な方法で検出できるトランスフェクションにFLAGまたは関連タグを含めることは、細胞株²³のトランスフェクション効率を評価するのに役立ちます。これは、トランスフェクションが成功したかどうかを判断し、タンパク質発現による検出の欠如を除外し、目的のタンパク質を発現する細胞の予想される割合の参照として役立ちます。

In situ ハイブリダイゼーション(ISH)は、細胞ペレット中の標的遺伝子発現を特徴付け、IHCメソッド開発に情報を提供するための有益なツールにもなり得る¹⁰。抗体をスクリーニングする場合、転写産物、ひいては潜在的なタンパク質がいつ検出されるかを知ることは有益です。さらに、細胞ペレットISHスクリーニングは、ISHメソッド開発に有益です。特異性はISHアッセイではそれほど頻繁には問題になりませんが、ISH研究に適用できるコントロールの開発と利用については、適切なコントロールと同様の考慮事項を持つことが依然として重要です。

組織マイクロアレイは、ドナーブロックからコアを除去し、これらのコアを、多くの場合グリッドパターンでレシピエントパラフィンブロックに移すことによって作成されます。最終的に、受信者ブロックは、単一のブロック内にサンプルのスペクトルを含み、ブロック内のすべてのサンプルが同一のIHC手順を経ることを可能にし、同じスライド上の複数のサンプルを直接比較することを可能にする^24,25。セルペレットは比較的均一な集団であるため、1 mmコアで正確に表すことができ、同様のアレイに含めるのに理想的な候補になります。細胞ペレットアレイを使用すると、さまざまな発現レベルの細胞ペレット、関連タンパク質を一意に発現する細胞ペレット、および異なる種由来の目的のタンパク質のオルソログを発現する細胞ペレットを1枚のスライドに含めることができます(図3)。これにより、試薬²⁵の使用を最小限に抑えながら、全ての細胞ペレットを均一な条件下で迅速に同時に評価することができる。

このプロトコルでは、8つのT175フラスコから収集された2mLの最小開始細胞ペレット容量が推奨されます。このボリュームにより、複数の細胞ペレットブロックの製造とアーカイブが可能になり、細胞ペレット制御を長期間にわたって標準化し、特定のペレットから複数の細胞ペレットアレイを作成できます。より低い細胞ペレット容量は、初代患者由来の細胞株、成長の遅い細胞株を扱う場合、または条件によってサンプルの量が制限される場合に使用できます。もちろん、開始量が少ないと、ペレットの固定および調製中の細胞損失による悪影響が強まり、下流プロセスに利用できる材料が制限されます。遠心分離後に固定液を除去する際には、関連する損失を最小限に抑えるために注意することが特に重要です。サンプル量が少ない場合は、1.5 mLのキャップ付き遠沈管を使用して細胞をペレット化できます。これらのチューブは、処理のためにブレードで縦方向に二等分することができます。

組織固定と同様に、このペレット内の細胞固定は、下流のIHC評価にとって重要です。完全な固定を達成するために、ホルマリンと細胞ペレットの比率を少なくとも10:1で使用し、円錐管を反転させて細胞を懸濁状態に維持します。固定時に細胞が懸濁状態でない場合、不完全または不十分な固定のリスクがあり、下流の免疫標識に影響を与えます。多くの場合、これは周辺での強い標識およびペレットの中心における標識の喪失またはペレット全体にわたる可変強度の標識として現れる。

このプロトコルは、主にヒドロキシエチルアガロースで構成されるヒストゲルを使用して、細胞ペレットに結合し、細胞を細胞ペレット全体に均一に分布させます。それがなければ、細胞は圧縮され、細胞形態学的詳細を失います。これらの細胞形態学的詳細は、抗体が適切な細胞内コンパートメント(核、細胞質、原形質膜など)で標識されているかどうかに関する追加情報を提供するため、抗体スクリーニング中に重要になることがよくあります。対照的に、ゲルが多すぎると、ペレット内の細胞密度が低くなり、細胞が広く分布し、セクションあたりの細胞数が減少します。

このプロトコルは、IHCコントロールの開発に日常的に使用できます。これらのペレットを作成するために必要な材料は、調査生物学および組織学の研究室では一般的であり、方法は簡単で適応が容易です。細胞ペレットはIHCコントロールとしての制限がありますが、初期抗体スクリーニングのための優れたツールとして機能し、他の組織コントロールを補完します。