Стандартизированная обработка для контроля иммуногистохимии гранул с фиксацией формалина, парафином и встроенными клетками

Этот протокол описывает методологию генерации формалин-фиксированных, парафин-внедренных клеточных гранул, которые могут быть использованы в качестве средств контроля для последующей иммуногистохимии и исследований гибридизации in situ. Гистологические методологии, описанные в этом протоколе, применимы к разнообразному спектру раковых и первичных клеточных линий и в первую очередь адаптируют рутинные методы гистологии для получения этих гранул^17,18. При обработке и внедрении гранулы могут использоваться аналогично тканям. Это включает в себя использование их с термоиндуцированными и ферментативными протоколами извлечения антигенов для экспериментов по иммуногистохимии. Одной из целей методологий, используемых в этом протоколе, является сохранение морфологии и антигенности клеток на протяжении всего процесса. Поэтому ЭДТА, которая является относительно мягкой с точки зрения изменений как морфологии, так и антигенности, используется для отделения клеток. Это не означает, что другие подходы, такие, как физическое разрушение, нежизнеспособны; однако любой подход к отделению клеток должен гарантировать, что клетки не будут повреждены в процессе. Второй целью этого протокола является фиксация и обработка клеток таким же образом, как и ткани, с использованием того же фиксирующего, фиксирующего соотношения, графика обработки (фиксация, обезвоживание, очистка и инфильтрация парафина) и методов внедрения, чтобы они могли служить сопоставимыми средствами контроля для последующих анализов. Следовательно, подходы к фиксации и обработке, используемые для генерации клеточных гранул, должны имитировать подходы, используемые для тканей.

Протокол, описанный в этом отчете, не адаптирован для обработки клеток с инфекционными агентами, такими как клетки, инфицированные патогенными бактериями или вирусами, поскольку клетки отделяются, собираются и центрифугируются перед фиксацией. Исследователи могут рассмотреть протоколы для фиксации клеток перед отслоением, но это потребует дальнейшей оптимизации для сбора клеток, не нарушая морфологию клеток. Кроме того, время фиксации и условия обработки клеток с инфекционными агентами требуют дополнительных соображений, основанных на инфекционном агенте и связанных с ним институциональных протоколах биобезопасности.

Гранулы клеток, фиксированные формалином, встроенные в парафин, уникально выгодны тем, что имеют четко определенные уровни экспрессии белка¹⁰. В то время как раковые и эндогенные клеточные линии предлагают выбор клеток с различными уровнями экспрессии белка, технологии генной инженерии позволяют ученым моделировать экспрессию белка путем чрезмерной экспрессии белков, представляющих интерес, и использования технологий CRISPR для иссечения или вставки кодирующих генов, представляющих интерес^20,21 . Недостатком чрезмерно экспрессированных белков в клеточных линиях является то, что они являются плохими показателями чувствительности анализа, поскольку они могут не представлять эндогенные уровни белка²². Напротив, как эндогенные клеточные линии, так и линии раковых клеток могут лучше представлять эндогенные уровни экспрессии, а CRISPR-опосредованная делеция кодирующего гена в родственной линии может служить соответствующим отрицательным контролем. Кроме того, эндогенные клеточные линии или линии раковых клеток с различными уровнями экспрессии белка идеально подходят для экспериментов по титрованию, чтобы выбрать окончательные разведения антител и лучше понять чувствительность анализа (рисунок 2). Решение о том, какие клеточные линии использовать, должно основываться на индивидуальных экспериментальных потребностях и часто будет использовать комбинацию подходов.

В дополнение к оценке того, может ли антитело обнаружить интересующий белок, панель клеточных линий может быть использована для определения специфичности антитела. Например, панель клеточных линий, которые индивидуально экспрессируют семейство тесно связанных белков, может быть использована для проверки того, является ли антитело специфичным для отдельного белка или обнаруживает ли оно также другие тесно связанные белки. Более сложные средства контроля могут включать использование клеточных линий, которые экспрессируют, либо через подделку CRISPR, либо через чрезмерную экспрессию, белки с точечными мутациями, которые не могут подвергаться специфическим сигнальным событиям, которые обнаруживаются (например, мутация в конкретных участках фосфорилирования при оценке фосфоспецифического антитела). Хотя это более сложные подходы, они могут быть необходимы для подтверждения того, что антитело используется только в определенных обстоятельствах¹⁰.

Важно отметить, что генетические манипуляции с клеточными линиями могут не генерировать однородную клеточную популяцию. Например, эффективность трансфекции при сверхэкспрессии клеточных линий обычно не составляет 100%, и некоторые клетки могут не чрезмерно экспрессировать интересующий белок. Включение FLAG или связанного тега в трансфекцию, которая может быть обнаружена стандартными методами, может быть полезно для оценки эффективности трансфекции клеточной линии²³. Это может быть полезно как для определения того, была ли трансфекция успешной, так и для исключения отсутствия обнаружения из-за экспрессии белка, так и для того, чтобы служить ориентиром для ожидаемой доли клеток, которые должны экспрессировать интересующий белок.

Гибридизация in situ (ISH) также может быть полезным инструментом для характеристики экспрессии генов-мишеней в клеточных гранулах и информирования о разработке метода^{IHC 10}. При скрининге антител может быть информативно знать, когда транскрипт и, следовательно, потенциальный белок могут быть обнаружены. Кроме того, скрининг клеточных гранул ISH может быть полезен для разработки метода ISH. Хотя специфичность реже является проблемой для анализов ISH, по-прежнему важно иметь соответствующие средства контроля и аналогичные соображения для разработки и использования средств контроля, которые могут быть применены к исследованиям ISH.

Тканевые микрочипы создаются путем удаления стержней из донорских блоков и переноса этих ядер, часто в виде сетки, в парафиновый блок реципиента. В конце концов, блок получателя содержит спектр образцов в одном блоке, что позволяет всем образцам в блоке проходить идентичные процедуры IHC и позволяет проводить прямое сравнение нескольких образцов на одном слайде^24,25. Поскольку клеточные гранулы представляют собой относительно однородные популяции, они могут быть точно представлены ядрами диаметром 1 мм, что делает их идеальными кандидатами для включения в аналогичные массивы. Используя клеточный грануляционный массив, можно включить клеточные гранулы с различными уровнями экспрессии, клеточные гранулы, которые уникально экспрессируют родственные белки, и клеточные гранулы, которые экспрессируют ортологи интересующего белка от разных видов в одном слайде (рисунок 3). Это позволяет одновременно быстро оценивать все клеточные гранулы в однородных условиях, сводя к минимуму использование реагентов²⁵.

Для этого протокола рекомендуется минимальный объем гранул стартовой ячейки 2 мл, собранных из восьми колб T175. Этот объем позволяет производить и архивировать блоки гранул с несколькими ячейками, так что элементы управления гранулами ячейки могут быть стандартизированы в течение более длительных периодов времени, а из данной гранулы могут быть созданы несколько массивов гранул ячеек. Более низкие объемы клеточных гранул могут быть использованы при работе с первичными клеточными линиями, полученными от пациента, медленно растущими клеточными линиями или когда условия ограничивают объем образца. Конечно, более низкие стартовые объемы будут потенцировать негативное влияние от любой потери клеток во время фиксации и приготовления гранулы и ограничат материал, доступный для последующих процессов. Особенно важно соблюдать осторожность при удалении фиксатора после центрифугирования, чтобы свести к минимуму любые связанные с этим потери. Для меньших объемов образцов для гранулирования ячеек может использоваться центрифужная трубка объемом 1,5 мл. Эти трубки могут быть продольно разделены пополам лезвием для обработки.

Подобно фиксации тканей, фиксация клеток в этой грануле имеет решающее значение для последующих оценок IHC. Чтобы достичь полной фиксации, мы используем, по крайней мере, соотношение формалина к грануле клетки 10: 1 и инвертируем коническую трубку для поддержания клеток в суспензии. Если клетки не находятся в суспензии в момент фиксации, существует риск неполной или неадекватной фиксации, что повлияет на последующую иммуномаркировку. Часто это проявляется в виде сильной маркировки на периферии и потери маркировки в центре гранулы или маркировки переменной интенсивности по всей грануле.

Этот протокол использует гистоген, который в основном состоит из гидроксиэтилагарии, как для связывания клеточной гранулы, так и для обеспечения равномерного распределения клеток по всей клеточной грануле. Без него клетки уплотняются и теряют свои цитоморфологические детали. Эти цитоморфологические детали часто важны во время скрининга антител, поскольку они предоставляют дополнительную информацию о том, маркируется ли антитело в соответствующем субклеточном компартменте (например, ядро, цитоплазма или плазматическая мембрана). Напротив, слишком много геля может привести к снижению плотности клеток внутри гранулы, что приводит к широкому распределению клеток и снижению количества клеток на секцию.

Этот протокол может регулярно использоваться для разработки средств контроля IHC. Материалы, необходимые для создания этих гранул, распространены в исследовательских лабораториях биологии и гистологии, а методы просты и легко адаптируются. В то время как клеточные гранулы имеют ограничения в качестве контроля IHC, они служат отличными инструментами для первоначального скрининга антител и дополняют другие средства контроля тканей.