Formalin-Sabit, Parafin-Gömülü Hücre Pelet İmmünohistokimya Kontrolleri için Standartlaştırılmış İşleme
Summary
Burada immünohistokimya için formalin-sabit, parafin-gömülü hücre pelet kontrolleri oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Hedef proteinlerin bilinen ekspresyonuna sahip pozitif ve negatif kontroller, immünohistokimya (IHC) tahlillerinin geliştirilmesi için gereklidir. Doku kontrolleri, tanımlanmış doku ve hücresel ekspresyon paternlerine sahip iyi karakterize edilmiş proteinler için faydalı olsa da, yeni, kötü karakterize edilmiş veya her yerde eksprese edilen proteinler için IHC tahlillerinin ilk gelişimi için daha az uygundur. Alternatif olarak, standartlaştırılmış doğaları nedeniyle, tanımlanmış protein veya transkript ekspresyon seviyelerine sahip kanser hücresi hatları (örneğin, yüksek, orta ve düşük ekspresyon), transfekte edilmiş aşırı eksprese edici hücre hatları veya CRISPR gibi hücre mühendisliği teknolojileri aracılığıyla silinen genlere sahip hücre hatları dahil olmak üzere hücre peletleri, özellikle ilk antikor karakterizasyonu ve seçimi için değerli kontroller olarak hizmet edebilir. Bu hücre peletlerinin formalin sabit, parafin gömülü dokular için IHC tahlillerinin geliştirilmesinde kullanılabilmesi için, doku işleme için kullanılan prosedürleri özetleyecek şekilde işlenmesi ve gömülmesi gerekir. Bu protokol, IHC yöntemi geliştirmeleri için kullanılabilecek formalin sabit, parafin gömülü hücre pelet kontrollerinin oluşturulması ve işlenmesi için bir süreci açıklar.
Introduction
İmmünohistokimya (IHC), araştırmacı ve tanısal patolojide en sık kullanılan testlerden biridir. Bağlama ve tahlil bağlı olarak, IHC kanser tanısında yardımcı olmakiçin kullanılır 1,2, tedavi yanıtı 3,4’ü tahmin etmek, patojenleri tanımlamak5, hastalıklı dokulardaki hücre tiplerini karakterize etmek6 ve biyolojik yolları ve doku yanıtlarını incelemek 7,8. Her durumda, bir IHC testinin temel prensibi, bir antikorun özellikle ilgilenilen bir hedefe, en yaygın olarak bir proteine bağlanmasıdır ve bu bağlanma olayı daha sonra bir doku bölüm9’da görselleştirilir. Bununla birlikte, herhangi bir IHC testinin en büyük zorluklarından biri, antikorların özellikle ilgilenilen hedefi tespit etmesinisağlamaktır 10. Antikor özgüllüğü çoğu immünotahlilde bir zorluktur, ancak immünohistokimya, spesifik ve spesifik olmayan etiketlemeyi ayırt etmek için moleküler ağırlık gibi ikincil önlemlerin bulunmaması nedeniyle benzersiz zorluklar sunar. Bu, iyi tanımlanmış hücresel lokalizasyon paternlerinden yoksun, kötü karakterize edilmiş veya her yerde ifade edilen hedefleri değerlendirirken özellikle zahmetlidir. Bu nedenle, yeni bir IHC testi 10 geliştirilirken bağlayıcı özgüllüğün karakterize edilmesine yardımcı olabilecek sağlam kontroller kritiköneme sahiptir.
Karakteristik hücresel ekspresyon paternleri ile iyi tanımlanmış hedefler için, doku kontrolleri IHC yöntemi geliştirmelerinde sıklıkla kullanılmaktadır. Önceki verilerin zenginliğine dayanarak, antikorun eksprese edildiği bilinen dokuyu, hücreyi ve hücre altı bölmeyi etiketleyip etiketlemediği ve bulunmaması gereken doku bileşenlerini etiketlemediği belirlenebilir11. Bununla birlikte, doku kontrolleri, bilinen ekspresyon kalıpları olmayan kötü karakterize edilmiş, yeni hedefler veya yaygın olarak eksprese edilen ve farklı ekspresyon kalıplarından yoksun proteinler için sınırlı bir kullanıma sahiptir. Bu senaryoların her ikisinde de, iyi tanımlanmış bir ifade kalıbının olmaması, dokulardaki spesifik olmayan etiketlemeden spesifik olanı ayırt etmeyi imkansız kılar. Bu durumlarda, hücre peletleri değerli bir alternatif IHC kontrolü sunar. Hücre pelet kontrolleri şunları içerebilir: ilgilenilen proteinin endojen veya intrinsik / indüklenmemiş ekspresyon seviyelerine sahip olan ve protein ekspresyonu batı lekelenmesi, akış sitometrik analizleri ile karakterize edilebilen veya transkripsiyonel profillemeden ekstrapolasyon yapılabilen kanser veya diğer hücre hatları; ilgilenilen proteini aşırı eksprese eden veya ilgilenilen kodlama genini sildiren tasarlanmış hücre hatları; veya protein ekspresyonunu veya ilgili sinyal olaylarını (örneğin, fosforilasyon) indüklemek için belirli koşullar altında tedavi edilmiş hücreler 10,12. Hücre hatlarındaki iyi karakterize edilmiş protein ekspresyon seviyeleri, yüksek, orta, düşük ve eksik protein ekspresyonuna sahip bir hücre hatları paneli kullanarak bir tahlilin duyarlılığının değerlendirilmesine de izin verir. Ek olarak, mühendislik hücre peletleri, sınırlı karakterizasyonun veya mevcut doku kontrollerinin olabileceği veteriner türleri için değerli türlere özgü kontroller olabilir13. Hücre peletlerinin, dokulardaki çeşitli proteomları yansıtmayacak hücre hatlarında bulunan sınırlı proteom gibi sınırlamaları olsa da, antikorun ilgilenilen hedefi tespit edebileceğini doğrulamak ve birincil antikor, ikincil antikor veya tahlil10’daki diğer regentler tarafından ayrım gözetmeksizin bağlanmayı dışlamak için uygun kontroller olarak hizmet ederler.
Tanısal ve araştırmacı patolojideki dokuların çoğu, nötr tamponlu formalinde sabitlenir, bir dizi alkolde dehidre edilir, ksilen içinde temizlenir ve parafin mumunda işlenir ve gömülür. Formalin fiksasyonu proteinleri çapraz bağlar ve fiksasyon ve doku işlemedeki her ek adım, proteinleri ve antikorların bunları tespit etme yeteneğini doğrudan etkileyebilir 9,14. Bu nedenle, bir IHC testinde kullanılan herhangi bir kontrolün aynı fiksasyon, doku işleme ve gömme prosedürlerinden geçmesi önemlidir. Bu makalede, formalin sabit parafin gömülü dokularda IHC tahlillerinin geliştirilmesi için kontrol görevi görecek şekilde kültürlenmiş hücrelerin işlenmesi ve gömülmesi için benzersiz hususlar anlatılmaktadır ve metodoloji öncelikle bir histoloji laboratuvarında hücre peletinin işlenmesi ve işlenmesine odaklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, aşağı akış immünohistokimyası ve in situ hibridizasyon çalışmaları için kontrol olarak kullanılabilecek formalin sabit, parafin gömülü hücre peletleri üretmek için bir metodolojiyi açıklamaktadır. Bu protokolde açıklanan histoloji metodolojileri, çeşitli kanser ve birincil hücre hatlarına uygulanabilir ve öncelikle bu peletleri üretmek için rutin histoloji tekniklerini uyarlar17,18. İşlendiğinde ve gömüldüğünde, peletler dokulara benzer şekilde kullanılabilir. Bu, immünohistokimya deneyleri için ısıya bağlı ve enzimatik antijen geri kazanım protokolleri ile birlikte kullanılmasını içerir. Bu protokolde kullanılan metodolojilerin bir amacı, süreç boyunca hücrelerin morfolojisini ve antijenitesini korumaktır. Bu nedenle, hem morfolojideki hem de antijenitedeki değişiklikler açısından nispeten yumuşak olan EDTA, hücrelerin ayrılması için kullanılır. Bu, fiziksel bozulma gibi diğer yaklaşımların uygulanabilir olmadığı anlamına gelmez; Bununla birlikte, hücreleri ayırmaya yönelik herhangi bir yaklaşım, hücrelerin süreçte zarar görmemesini sağlamalıdır. Bu protokolün ikinci amacı, hücreleri dokulara benzer bir şekilde, aynı fiksatif, fiksatif oranı, işleme programını (fiksasyon, dehidrasyon, temizleme ve parafin infiltrasyonu) ve gömme tekniklerini kullanarak sabitlemek ve işlemektir, böylece aşağı akış tahlilleri için karşılaştırılabilir kontroller olarak hizmet edebilirler. Bu nedenle, hücre peletleri üretmek için kullanılan fiksasyon ve işleme yaklaşımları, dokular için kullanılan yaklaşımları taklit etmelidir.
Bu raporda açıklanan protokol, patojenik bakteri veya virüslerle enfekte olmuş hücreler gibi bulaşıcı ajanlara sahip hücreleri işlemek için uyarlanmamıştır, çünkü hücreler fiksasyondan önce ayrılır, toplanır ve santrifüj edilir. Araştırmacılar, ayrılmadan önce hücreleri sabitlemek için protokolleri düşünebilirler, ancak bu, hücre morfolojisini bozmadan hücreleri toplamak için daha fazla optimizasyon gerektirecektir. Ayrıca, enfeksiyöz ajanlı hücreler için fiksasyon süreleri ve taşıma koşulları, enfeksiyöz ajana ve ilgili kurumsal biyogüvenlik protokollerine dayanan ek hususlar gerektirir.
Formalin-sabit, parafin-gömülü hücre peletleri, iyi tanımlanmış protein ekspresyon seviyelerine sahip olma konusunda benzersiz bir avantaja sahiptir10. Kanser ve endojen hücre hatları, farklı seviyelerde protein ekspresyonuna sahip hücrelerin bir seçimini sunarken, genetik mühendisliği teknolojileri, bilim adamlarının, ilgilenilen proteinleri aşırı ifade ederek ve ilgi çekici kodlama genlerini çıkarmak veya eklemek için CRISPR teknolojilerinin kullanılması yoluyla protein ekspresyonunu modellemelerini sağlar20,21 . Hücre hatlarında aşırı eksprese edilen proteinlerin dezavantajı, endojen protein seviyelerini temsil etmeyebilecekleri için bir tahlilin duyarlılığı için zayıf ölçümler olmalarıdır22. Buna karşılık, hem endojen hücre hatları hem de kanser hücre hatları endojen ekspresyon seviyelerini daha iyi temsil edebilir ve bir konyak hattındaki kodlama geninin CRISPR aracılı silinmesi, karşılık gelen bir negatif kontrol görevi görebilir. Ayrıca, endojen hücre hatları veya farklı seviyelerde protein ekspresyonuna sahip kanser hücre hatları, nihai antikor seyreltmelerini seçmek ve bir tahlilin duyarlılığını en iyi şekilde anlamak için titrasyon deneyleri için idealdir (Şekil 2). Hangi hücre hatlarının kullanılacağını çevreleyen karar, bireysel deneysel ihtiyaçlara dayanmalıdır ve genellikle yaklaşımların bir kombinasyonunu kullanacaktır.
Bir antikorun ilgilenilen proteini tespit edip edemeyeceğini değerlendirmenin yanı sıra, bir antikorun özgüllüğünü tanımlamak için bir hücre hatları paneli kullanılabilir. Örneğin, yakından ilişkili proteinlerden oluşan bir aileyi ayrı ayrı ifade eden bir hücre hatları paneli, bir antikorun bireysel bir protein için spesifik olup olmadığını veya yakından ilişkili diğer proteinleri de tespit edip etmediğini test etmek için kullanılabilir. Daha ayrıntılı kontroller, CRISPR knock-in veya aşırı ekspresyon yoluyla, tespit edilmekte olan spesifik sinyal olaylarına (örneğin, fosfo-spesifik bir antikoru değerlendirirken spesifik fosforilasyon bölgelerindeki mutasyon) maruz kalamayan nokta mutasyonlarına sahip proteinleri eksprese eden hücre hatlarının kullanılmasını içerebilir. Bunlar daha karmaşık yaklaşımlar olsa da, antikorun belirli koşullar altında sadece etiket kullandığını doğrulamak için gerekli olabilirler10.
Hücre hatlarının genetik manipülasyonlarının homojen bir hücre popülasyonu oluşturmayabileceğine dikkat etmek önemlidir. Örneğin, hücre çizgilerini aşırı eksprese etmede transfeksiyon etkinliği tipik olarak% 100 değildir ve bazı hücreler ilgilenilen proteini aşırı eksprese etmeyebilir. Transfeksiyona standart yöntemlerle tespit edilebilen FLAG veya ilgili bir etiketin dahil edilmesi, hücre satırı23’ün transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için yararlı olabilir. Bu, hem transfeksiyonun başarılı olup olmadığını belirlemek hem de protein ekspresyonu nedeniyle tespit eksikliğini dışlamak ve ilgilenilen proteini ifade etmesi gereken hücrelerin beklenen oranı için bir referans görevi görmek için yararlı olabilir.
In situ hibridizasyon (ISH), hücre peletlerindeki hedef gen ekspresyonunu karakterize etmek ve IHC yöntem gelişimini bilgilendirmek için yararlı bir araç olabilir10. Antikorları tararken, transkriptin ve dolayısıyla potansiyel proteinin ne zaman tespit edilebileceğini bilmek bilgilendirici olabilir. Ek olarak, hücre peleti ISH taraması ISH yönteminin geliştirilmesi için faydalı olabilir. Özgüllük, ISH tahlilleri için daha az sıklıkla bir sorun olsa da, ISH çalışmalarına uygulanabilecek kontrollerin geliştirilmesi ve kullanılması için uygun kontrollere ve benzer hususlara sahip olmak hala önemlidir.
Doku mikrodizileri, çekirdeklerin donör bloklardan çıkarılması ve bu çekirdeklerin, genellikle ızgara düzeninde, bir alıcı parafin bloğuna aktarılmasıyla oluşturulur. Sonunda, alıcı blok tek bir blokta bir numune spektrumu içerir, bu da bloktaki tüm numunelerin aynı IHC prosedürlerinden geçmesine izin verir ve aynı slayt24,25’teki birden fazla numunenin doğrudan karşılaştırılmasına izin verir. Hücre peletleri nispeten homojen popülasyonlar olduğundan, 1 mm çekirdeklerle doğru bir şekilde temsil edilebilirler, bu da onları benzer dizilere dahil etmek için ideal adaylar haline getirir. Bir hücre pelet dizisi kullanarak, farklı ekspresyon seviyelerine sahip hücre peletlerini, ilgili proteinleri benzersiz bir şekilde ifade eden hücre peletlerini ve farklı türlerden ilgilenilen proteinin ortologlarını eksprese eden hücre peletlerini tek bir slaytta dahil etmek mümkündür (Şekil 3). Bu, tüm hücre peletlerinin aynı anda tek tip koşullar altında hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlarken, reaktiflerin kullanımını en aza indirir25.
Bu protokol için sekiz T175 şişesinden toplanan minimum 2 mL’lik bir başlangıç hücresi pelet hacmi önerilir. Bu hacim, çoklu hücre pelet bloklarının üretilmesine ve arşivlenmesine izin verir, böylece hücre pelet kontrolleri daha uzun süreler boyunca standartlaştırılabilir ve belirli bir peletten çoklu hücre pelet dizileri oluşturulabilir. Alt hücre pelet hacimleri, birincil hasta kaynaklı hücre hatları, yavaş büyüyen hücre hatları ile uğraşırken veya koşullar numunenin hacmini sınırladığında kullanılabilir. Tabii ki, daha düşük başlangıç hacimleri, peletin sabitlenmesi ve hazırlanması sırasında herhangi bir hücre kaybından kaynaklanan olumsuz etkiyi güçlendirecek ve aşağı akış prosesleri için mevcut malzemeyi sınırlayacaktır. Santrifüjlemeden sonra fiksatif çıkarılırken, ilişkili kayıpları en aza indirmek için özellikle dikkat etmek önemlidir. Daha düşük numune hacimleri için, hücreleri peletlemek için 1,5 mL, kapaklı bir santrifüj tüpü kullanılabilir. Bu tüpler, işleme için bir bıçakla uzunlamasına ikiye bölünebilir.
Doku fiksasyonuna benzer şekilde, bu pelet içindeki hücre fiksasyonu, aşağı akış IHC değerlendirmeleri için kritik öneme sahiptir. Tam fiksasyon elde etmek için, en az 10: 1 formalin – hücre pelet oranı kullanıyoruz ve hücreleri süspansiyonda tutmak için konik tüpü tersine çeviriyoruz. Fiksasyon sırasında hücreler süspansiyonda değilse, aşağı akış immünoetiketlemesini etkileyecek eksik veya yetersiz fiksasyon riski vardır. Genellikle bu, çevrede güçlü etiketleme ve pelet merkezinde etiketleme kaybı veya pelet boyunca değişken yoğunlukta etiketleme olarak kendini gösterir.
Bu protokol, hem hücre peletini bağlamak hem de hücrelerin hücre peleti boyunca eşit olarak dağılmasını sağlamak için öncelikle hidroksietil agarozdan oluşan Histogel’i kullanır. Onsuz, hücreler sıkışır ve sitomorfolojik ayrıntılarını kaybeder. Bu sitomorfolojik detaylar genellikle antikor taraması sırasında önemlidir, çünkü antikorun uygun hücre altı bölmede (örneğin, çekirdek, sitoplazma veya plazma zarı) etiketlenip etiketlenmediğine dair ek bilgi sağlarlar. Buna karşılık, çok fazla jel, pelet içinde daha düşük hücre yoğunluklarına neden olabilir, bu da hücrelerin yaygın olarak dağılmasına ve bölüm başına hücre sayısının azalmasına neden olabilir.
Bu protokol, IHC kontrollerini geliştirmek için rutin olarak kullanılabilir. Bu peletleri oluşturmak için gereken malzemeler araştırmacı biyoloji ve histoloji laboratuvarlarında yaygındır ve yöntemler basit ve uyarlanması kolaydır. Hücre peletleri IHC kontrolleri olarak sınırlamalara sahip olsa da, ilk antikor taraması için harika araçlar olarak hizmet ederler ve diğer doku kontrollerini tamamlarlar.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Genentech’in Araştırma organizasyonundaki meslektaşlarımızın ve özellikle de yıllar içinde bu yöntemlerin geliştirilmesine katkıda bulunan Patoloji çekirdek (P-core) laboratuvarlarının işbirliğine teşekkür ederiz.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| 50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
| 70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
| 95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
| Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
| Flex 100 | Epredia | 8101 | |
| Flex 95 | Epredia | 8201 | |
| Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
| Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
| Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
| Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
| Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Wennerberg, A. E., Nalesnik, M. A., Coleman, W. B. Hepatocyte paraffin 1: a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors. American Journal of Pathology. 143 (4), 1050-1054 (1993).
- Chu, P. G., Ishizawa, S., Wu, E., Weiss, L. M. Hepatocyte antigen as a marker of hepatocellular carcinoma. American Journal of Surgical Pathology. 26 (8), 978-988 (2002).
- Cobleigh, M. A., et al. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. Journal of Clinical Oncology. 17 (9), 2639-2648 (1999).
- Vogel, C. L., et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 719-726 (2002).
- Webster, J. D., Miller, M. A., DuSold, D., Ramos-Vara, J. A. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Veterinary Pathology. 47 (3), 529-535 (2010).
- Havnar, C., et al. Characterization of tumor-immune microenvironment by high-throughput image analysis of CD8 immunohistochemistry combined with modified Masson’s trichrome. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 69 (9), 611-615 (2021).
- Newton, K., et al. RIPK1 inhibits ZPB1-driven necroptosis during development. Nature. 540 (7631), 129-133 (2016).
- Webster, J. D., Solon, M., Haller, S., Newton, K. Detection of necroptosis by phospho-RIPK3 immunohistochemical labeling. Methods in Molecular Biology. 1857, 153-160 (2018).
- Ramos, J. A., Miller, M. A., et al. When antibodies and antigens get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry-the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
- Webster, J. D., Solon, M., Gibson-Corley, K. N. Validating immunohistochemistry assay specificity in investigative studies: consideration for a weight of evidence approach. Veterinary Pathology. 58 (5), 829-840 (2021).
- Ramos-Vara, J. A., et al. American association of veterinary laboratory diagnosticians subcommittee on standardization of immunohistochemistry suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (4), 393-413 (2008).
- Dominguez, S., et al. Genetic inactivation of RIP1 kinase does not ameliorate disease in a mouse model of ALS. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 915-931 (2021).
- Lean, F. Z. X., et al. Differential susceptibility of SARS-CoV-2 in animals: evidence of ACE2 host receptor distribution in companion animals, livestock and wildlife by immunohistochemical characterization. Transboundary and Emerging Disease. , 14232 (2021).
- Dunstan, R. W., Wharton, K. A., Quigley, C., Lowe, A. The use of immunohistochemistry for biomarker assessment-can it compete with other technologies. Toxicologic Pathology. 39 (6), 988-1002 (2011).
- Thermo Fisher Scientific. . Cell Culture Basics Handbook. , (2020).
- Carson, F. . Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2nd Ed. , (1997).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D., Spencer, L. T., Bancroft, J. D. Tissue Processing. Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Ed. , (2013).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue Microarrays. Cancer Gene Profiling. , 53-65 (2016).
- Jinek, M., et al. Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The Histochemical Society’s standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Ferrando, R., Newton, K., Chu, F., Webster, J., French, D. Immunohistochemical detection of FLAG-tagged endogenous proteins in knock-in mice. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (4), 244-255 (2015).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nature Medicine. 4 (7), 844-847 (1998).
- Moch, H., Kononen, J., Kallioniemi, O. P., Sauter, G. Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology. Advances in Anatomic Pathology. 8 (1), 14-20 (2001).
