Gestandaardiseerde verwerking voor formaline-vaste, paraffine-ingebedde cel pellet immunohistochemische controles

Dit protocol beschrijft een methodologie om formaline-vaste, paraffine-ingebedde celpellets te genereren die kunnen worden gebruikt als controles voor downstream immunohistochemie en in situ hybridisatiestudies. De histologische methodologieën die in dit protocol worden beschreven, zijn van toepassing op een breed scala aan kanker- en primaire cellijnen en passen voornamelijk routinematige histologische technieken aan om deze pellets te produceren^17,18. Wanneer ze worden verwerkt en ingebed, kunnen de pellets op dezelfde manier worden gebruikt als weefsels. Dit omvat het gebruik ervan met warmte-geïnduceerde en enzymatische antigeen ophaalprotocollen voor immunohistochemische experimenten. Een doel van de methodologieën die in dit protocol worden gebruikt, is om de morfologie en antigeniciteit van de cellen gedurende het hele proces te behouden. Daarom wordt EDTA, dat relatief zacht is in termen van veranderingen in zowel de morfologie als de antigeniciteit, gebruikt voor het losmaken van de cellen. Dit wil niet zeggen dat andere benaderingen, zoals fysieke verstoring, niet levensvatbaar zijn; elke benadering om cellen los te maken moet er echter voor zorgen dat de cellen niet gewond raken tijdens het proces. Het tweede doel van dit protocol is om de cellen te fixeren en te verwerken op een manier die vergelijkbaar is met weefsels, met behulp van dezelfde fixatieve, fixatieve ratio, verwerkingsschema (fixatie, dehydratie, clearing en paraffine-infiltratie) en inbeddingstechnieken, zodat ze kunnen dienen als vergelijkbare controles voor downstream-testen. Daarom moeten de fixatie- en verwerkingsbenaderingen die worden gebruikt om celpellets te genereren, de benaderingen nabootsen die voor weefsels worden gebruikt.

Het protocol dat in dit rapport wordt beschreven, is niet aangepast om cellen met infectieuze agentia te behandelen, zoals cellen die zijn geïnfecteerd met pathogene bacteriën of virussen, omdat cellen worden losgemaakt, verzameld en gecentrifugeerd voordat ze worden gefixeerd. Onderzoekers kunnen protocollen overwegen om de cellen te fixeren voordat ze worden losgemaakt, maar dit zou verdere optimalisatie vereisen om de cellen te verzamelen zonder de celmorfologie te verstoren. Bovendien vereisen fixatietijden en behandelingsomstandigheden voor cellen met infectieuze agentia aanvullende overwegingen op basis van het infectieuze agens en de bijbehorende institutionele bioveiligheidsprotocollen.

Formaline-vaste, paraffine-ingebedde celpellets zijn uniek voordelig in het hebben van goed gedefinieerde eiwitexpressieniveaus¹⁰. Terwijl kanker en endogene cellijnen een selectie van cellen met verschillende niveaus van eiwitexpressie bieden, stellen genetische manipulatietechnologieën wetenschappers in staat om de eiwitexpressie te modelleren, door middel van overexpressie van interessante eiwitten en het gebruik van CRISPR-technologieën om coderende genen van belang te verwijderen of in te voegen^20,21 . Het nadeel van overgeexpresseerde eiwitten in cellijnen is dat het slechte maatstaven zijn voor de gevoeligheid van een test, omdat ze mogelijk geen endogene eiwitniveaus²² vertegenwoordigen. Daarentegen kunnen zowel endogene cellijnen als kankercellijnen de endogene expressieniveaus beter weergeven, en CRISPR-gemedieerde deletie van het coderende gen in een cognatelijn kan dienen als een overeenkomstige negatieve controle. Bovendien zijn endogene cellijnen of kankercellijnen met verschillende niveaus van eiwitexpressie ideaal voor titratie-experimenten om uiteindelijke antilichaamverdunningen te kiezen en de gevoeligheid van een test het beste te begrijpen (figuur 2). De beslissing over welke cellijnen te gebruiken moet gebaseerd zijn op individuele experimentele behoeften en zal vaak een combinatie van benaderingen gebruiken.

Naast het evalueren of een antilichaam het eiwit van belang kan detecteren, kan een panel van cellijnen worden gebruikt om de specificiteit van een antilichaam te definiëren. Een panel van cellijnen die individueel een familie van nauw verwante eiwitten tot expressie brengen, kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te testen of een antilichaam specifiek is voor een individueel eiwit of dat het ook andere nauw verwante eiwitten detecteert. Meer uitgebreide controles kunnen betrekking hebben op het gebruik van cellijnen die, hetzij door CRISPR knock-in of door overexpressie, eiwitten tot expressie brengen met puntmutaties die geen specifieke signaleringsgebeurtenissen kunnen ondergaan die worden gedetecteerd (bijvoorbeeld mutatie in specifieke fosforyleringsplaatsen bij het evalueren van een fosfo-specifiek antilichaam). Hoewel dit complexere benaderingen zijn, kunnen ze nodig zijn om te bevestigen dat het antilichaam onder specifieke omstandigheden alleen labels gebruikt¹⁰.

Het is belangrijk op te merken dat genetische manipulaties van cellijnen mogelijk geen homogene celpopulatie genereren. De transfectie-efficiëntie bij het overexpressie van cellijnen is bijvoorbeeld meestal niet 100% en sommige cellen kunnen het eiwit van belang niet overexpressie geven. Opname van FLAG of een gerelateerde tag in de transfectie die met standaardmethoden kan worden gedetecteerd, kan nuttig zijn om de transfectie-efficiëntie van de cellijn te beoordelen²³. Dit kan nuttig zijn om te bepalen of transfectie succesvol was en om een gebrek aan detectie als gevolg van de eiwitexpressie uit te sluiten, en om als referentie te dienen voor het verwachte aandeel cellen dat het eiwit van belang zou moeten uitdrukken.

In situ hybridisatie (ISH) kan ook een nuttig hulpmiddel zijn om de doelgenexpressie in celpellets te karakteriseren en de ontwikkeling van IHC-methoden^{te informeren 10}. Bij het screenen van antilichamen kan het informatief zijn om te weten wanneer het transcript, en dus het potentiële eiwit, kan worden gedetecteerd. Bovendien kan ish-screening van celpellets gunstig zijn voor de ontwikkeling van ish-methoden. Hoewel specificiteit minder vaak een probleem is voor ISH-assays, is het nog steeds belangrijk om geschikte controles en soortgelijke overwegingen te hebben voor de ontwikkeling en het gebruik van controles die kunnen worden toegepast op ISH-studies.

Weefselmicroarrays worden gecreëerd door kernen uit donorblokken te verwijderen en deze kernen, vaak in een rasterpatroon, over te brengen in een ontvangend paraffineblok. Uiteindelijk bevat het ontvangersblok een spectrum van monsters in een enkel blok, waardoor alle monsters in het blok identieke IHC-procedures kunnen doorlopen en de directe vergelijking van meerdere monsters op dezelfde dia^{mogelijk is 24,25}. Omdat celpellets relatief uniforme populaties zijn, kunnen ze nauwkeurig worden weergegeven door 1 mm-kernen, waardoor ze ideale kandidaten zijn voor opname in vergelijkbare arrays. Met behulp van een celpelletarray is het mogelijk om celpellets met verschillende expressieniveaus, celpellets die op unieke wijze verwante eiwitten tot expressie brengen, en celpellets die orthologen van het eiwit van belang van verschillende soorten in één dia tot expressie brengen (figuur 3). Hierdoor kunnen alle celpellets tegelijkertijd onder uniforme omstandigheden op een snelle manier worden geëvalueerd, terwijl het gebruik van reagentia wordt geminimaliseerd²⁵.

Een minimaal volume startcelpellets van 2 ml verzameld uit acht T175-kolven wordt aanbevolen voor dit protocol. Dit volume maakt de productie en archivering van meerdere celpelletblokken mogelijk, zodat celpelletcontroles over langere perioden kunnen worden gestandaardiseerd en meerdere celpelletarrays kunnen worden gemaakt van een bepaalde pellet. Lagere celpelletvolumes kunnen worden gebruikt bij het omgaan met primaire patiënt-afgeleide cellijnen, langzaam groeiende cellijnen of wanneer omstandigheden het volume van het monster beperken. Natuurlijk zullen lagere startvolumes de negatieve impact van elk celverlies tijdens fixatie en bereiding van de pellet versterken en het materiaal dat beschikbaar is voor downstream-processen beperken. Het is vooral belangrijk om voorzichtig te zijn bij het verwijderen van fixatief na centrifugatie, om eventuele bijbehorende verliezen te minimaliseren. Voor lagere monstervolumes kan een centrifugebuis van 1,5 ml worden gebruikt om de cellen te pelleteren. Deze buizen kunnen in de lengterichting worden doorsneden met een mes voor verwerking.

Net als bij weefselfixatie is celfixatie in deze pellet van cruciaal belang voor downstream IHC-beoordelingen. Om volledige fixatie te bereiken, gebruiken we ten minste een 10: 1 formaline-celpelletverhouding en keren we de conische buis om de cellen in suspensie te houden. Als de cellen niet in suspensie zijn op het moment van fixatie, bestaat het risico van onvolledige of ontoereikende fixatie, wat de downstream immunolabeling zal beïnvloeden. Vaak manifesteert dit zich als sterke etikettering in de periferie en verlies van etikettering in het midden van de pellet of etikettering van variabele intensiteit in de pellet.

Dit protocol maakt gebruik van Histogel, dat voornamelijk bestaat uit hydroxyethyl agarose, om zowel de celpellet te binden als om de cellen gelijkmatig over de celpellet te verdelen. Zonder dit worden cellen verdicht en verliezen ze hun cytomorfologische details. Deze cytomorfologische details zijn vaak belangrijk tijdens antilichaamscreening, omdat ze aanvullende informatie geven over de vraag of het antilichaam zich in het juiste subcellulaire compartiment (bijv. De kern, het cytoplasma of het plasmamembraan) labelt. Daarentegen kan te veel gel resulteren in lagere celdichtheden in de pellet, waardoor de cellen wijd verspreid zijn en het aantal cellen per sectie wordt verminderd.

Dit protocol kan routinematig worden gebruikt om IHC-controles te ontwikkelen. De materialen die nodig zijn om deze pellets te maken, zijn gebruikelijk in laboratoria voor onderzoeksbiologie en histologie, en de methoden zijn eenvoudig en gemakkelijk aan te passen. Hoewel celpellets beperkingen hebben als IHC-controles, dienen ze als geweldige hulpmiddelen voor initiële antilichaamscreening en vullen ze andere weefselcontroles aan.